整合素ανβ6靶向免疫脂质体作为肿瘤特异性药物载体在结肠癌治疗中的研究和应用

发布时间：2018-04-08 14:03

本文选题：整合素avβ6　切入点：免疫脂质体　出处：《山东大学》2017年博士论文

【摘要】：研究背景结肠癌是全世界发病率第三位的恶性肿瘤,而病死率在所有恶性肿瘤中位于第四位。根治性手术治疗仍然是结肠癌的首选治疗方法,而对于淋巴结阳性和存在远处转移的Ⅲ期及以上结肠癌患者,手术联合以5-氟尿嘧啶(5-FU)为基础的辅助化疗相对于单纯手术治疗而言能够将结肠癌病死率降低25%,从而显著提高结肠癌的5年生存率。然而,结肠癌患者中对化疗敏感的仅占100%～20%,这严重影响了结肠癌化疗效果。因此,研究和探索化疗新策略以提高化疗在结肠癌中的疗效对于改善结肠癌病死率和提高生存率方面有十分重要的意义。脂质体是由磷脂和胆固醇在水中分散形成的具有类似细胞双分子层结构的膜性小泡,将化疗药物包封在脂质体中可以起到药物载体的作用。脂质体装载药物后,其特有的双层膜结构可以对药物起到保护,药物稳定性得以提高。同时,也可以延缓药物的代谢和排泄,从而延长药物作用时间。起初脂质体并未应用于药物载体,而是用于研究生物膜系统,后来随着研究的深入和扩展以及脂质体制备工艺的完善,加之其无毒性和免疫原性等特性,脂质体成为了理想的药物载体。作为药物载体,脂质体具有降低用药剂量、提高治疗效果和减轻毒副作用的优点。目前,各种脂质体制剂已广泛用于临床中疾病的治疗,尤其是在肿瘤化疗领域。但是由于血液循环中白蛋白、抗体、调理素等的作用破坏了脂质体的结构,影响了其稳定性,导致内封药物渗漏,无法达到药物理想的化疗效果。为此,人们将亲水性的聚乙二醇(PEG)修饰于普通脂质体表面进而合成了一种长循环脂质体,该脂质体能够逃避血浆中调理素与其结合从而避免被巨噬细胞摄取,从而提高自身的稳定性,最终延长体内循环时间,药物在血液循环中的半衰期也明显提高。同时,对于肿瘤病变,局部毛细血管通透性增加,长循环脂质体作为药物载体能增加化疗药物在肿瘤组织内的蓄积,从而提高了药物的疗效。但是,长循环脂质体与肿瘤细胞的相互作用是被动的、非特异性的,导致所载药物不仅被肿瘤组织细胞摄取,还会渗透到周围正常组织,最终降低药物治疗效果以及增加毒副作用。免疫脂质体(immunoliposomes)是将单克隆抗体或其片段连接于长循环脂质体表面而合成的具有特异性识别靶细胞能力的特殊类型脂质体,其借助抗体与靶细胞表面抗原特异性的识别作用,准确与靶细胞结合并将药物特异性运输至靶细胞内。免疫脂质体不仅具有一般长循环脂质体生物稳定性好的特点,更具有主动识别靶向细胞的优势。因此,免疫脂质体是理想的肿瘤靶向药物载体。到目前为止,已经研发和报道了针对CD30,HER2/neu,EGFR和VEGFR等多种肿瘤特异性抗原靶点的免疫脂质体,研究证实,这些免疫脂质体能够显著提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。整合素αvβ6是仅在上皮组织表达的一种整合素亚型,通过与其受体结合而介导细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的联系。该整合素在胚胎发生、组织修复以及肿瘤组织中表达升高,而在健康上皮组织细胞中低表达或不表达。对于结肠癌,整合素αvβ6特异性的表达于肿瘤组织,但是在周围正常组织没有表达。同时,整合素αvβ6的表达与结肠癌的病理类型、分化程度、TNM分期密切相关,并且结肠癌肿瘤组织整合素αvβ6阳性的患者生存期明显缩短,其表达可作为结肠癌不良预后指标。在化疗耐药方面,整合素αvβ6可以增强结肠癌细胞抵御调亡和产生耐药性的能力。因此,鉴于其在结肠癌组织表达的特异性以及其在结肠癌恶性行为中的作用,整合素αvβ6无疑是结肠癌化疗的优良靶点。整合素αvβ6已经作为临床生物标志物用于胰腺癌、胃癌、结肠癌等恶性肿瘤的早期检测。此外,针对整合素αvβ6信号通路的阻断剂也已用于多种肿瘤的靶向治疗。然而,将整合素αvβ6作为药物载体系统的靶点,用于提高结肠癌化疗效果的研究尚未见报道。本研究中,我们合成制备了以整合素αvβ6为靶点的免疫脂质体,并对其药物包封率、粒径等性质进行了检测。同时通过体内体外实验验证其作为药物载体在提高5-FU对结肠癌化疗效果中的作用。第一部分整合素αvβ6靶向免疫脂质体的制备及其相关性质检测目的制备以整合素αvβ6为靶点的免疫脂质体,并对其相关性质进行检测。方法采用逆向旋转蒸发法制备聚乙二醇化的脂质体(PEG-脂质体),然后应用后嵌入的方法将整合素αvβ6单克隆抗体通过交联剂与脂质体表面的带有氨基修饰的PEG连接,从而制得抗αvβ6-免疫脂质体。采用激光粒度仪、扫描电镜分析脂质体的粒径和电位大小。制备装载5-FU的抗αvβ6-免疫脂质体制剂,高效分光光度仪分析抗αvβ6-免疫脂质体的药物包封率及体外药物释放率。结果抗αvβ6-免疫脂质体呈球型或半球形,分散均匀;脂质体平均粒径为405.1±2.74nm,Zeta点位为-8.18±1.83mV。分光)光度仪分析该免疫脂质体的5-FU包封率为75.95%±2.30%,体外释放曲线显示抗αvβ6-免疫脂质体在PBS和血清中具有与PEG-脂质体相似的缓释性,96h释放分别可达90%和50%以上。同时,介质的pH值对抗αvβ6-免疫脂质体释放率的影响较小。结论本部分证实首先应用逆向旋转蒸发法制备聚乙二醇化的脂质体(PEG-脂质体),然后将整合素αvβ6单克隆抗体通过交联剂后嵌入脂质体表面制备抗αvβ6-免疫脂质体是一种可行的方法。并且,制备的装载5-FU的抗αvβ6-免疫脂质体制剂具有较高的药物包封率和较好的体外释放率。第二部分整合素αvβ6靶向免疫脂质体对结肠癌细胞的靶向效应和抗肿瘤效果研究目的研究抗αvβ6-免疫脂质体对结肠癌细胞的主动靶向作用,同时探讨抗αvβ6-免疫脂质体作为药物载体提高化疗药物抗肿瘤效果的机制。方法1.流式细胞技术检测结肠癌细胞系HT-29和SW480表面整合素αvβ6的表达情况。2.按照第一部分的方法制备装载香豆素-6的抗αvβ6-免疫脂质体:荧光倒置显微镜、流式细胞仪分析结肠癌细胞系HT-29和SW480β6对整合素αvβ6靶向脂质体的摄取情况。3.利用Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)实验测定装载5-FU的抗αvβ6-免疫脂质体制剂对结肠癌细胞的毒性。4.流式细胞技术分析装载5-FU的抗αv36-免疫脂质体对结肠癌细胞凋亡的影响。5.Western blotting 实验检测 Cytochrome C、Caspase-9/3、Cleaved caspase3、Cleaved PARP等凋亡相关蛋白表达的影响;Caspase活性试验分析处理后结肠癌细胞Caspase活性变化。结果1.在结肠癌细胞系HT-29中,与未处理组(untreated)和空白质粒对照组(Con-siRNA)相比,β6干扰组(β6-siRNA)的HT-29细胞整合素αvβ6的表达明降低。而对于整合素αvβ6阴性的结肠癌细胞系SW480,β6转染组(β6 transfected)相较于野生型(wild type)和对照组(Mock transfectant),整合素αvβ6的表达明显升高。2.对于整合素αvβ6表达阳性的结肠癌HT-29和SW480β6细胞,细胞对抗αvβ6-免疫脂质体的摄取明显高于PEG-脂质体。然而,对于整合素αvβ6表达降低或者阴性的结肠癌HT-29(β6-siRNA转染组)和SW480细胞,细胞对抗αvβ6-免疫脂质体的摄取低于HT-29和SW480β6细胞。3.CCK-8实验结果显示,装载5-FU的抗αvβ6-免疫脂质体较PEG-脂质体能够显著抑制结肠癌HT-29和SW480β6细胞的活性,同时明显降低5-FU的半数抑制浓度。4.流式细胞技术检测结肠癌细胞凋亡,对于结肠癌HT-29和SW480β6细胞,抗αvβ6-免疫脂质体组的细胞凋亡率分别为21.91%±1.62%和26.18%±2.43%,明显高于PEG-脂质体组的14.53%±0.99%和16.61%±1.23%,以及游离5-FU组的 8.99±1.00%和 12.77±1.21%。5.在抗 αvβ6-免疫脂质体组,细胞凋亡蛋白Cytochrome C、Cleaved caspase-3以及Cleaved PARP的表达明显升高,同时Caspase-9和Caspase-3的活性也显著提高。结论抗αvβ6-免疫脂质体能够明显增强与整合素αvβ6阳性结肠癌细胞的相互作用,从而促进结肠癌细胞对脂质体的摄取。同时,抗αvβ6-免疫脂质体可以显著提高5-FU诱导结癌凋细胞凋亡的作用。其机制可能与CytochromeC-Caspase-9/3线粒体凋亡通路的活化增强相关。第三部分整合素αvβ6靶向脂质体在体内对结肠癌的靶向效应和抗肿瘤效果研究目的研究抗αvβ6-免疫脂质体在体内对药物的主动靶向运输作用,以及抗αvβ6-免疫脂质体作为化疗药物载体对结肠癌的化疗效果的影响。方法1.BALB/c裸鼠分别皮下注射结肠癌HT-29和SW480β6细胞系,建立裸鼠结肠癌异种移植瘤模型。2.选取肿瘤体积≥100mm3的结肠癌荷瘤裸鼠,随机分为3组,分别经尾静脉注射游离5-FU、5-FU-PEG-脂质体以及5-FU-抗αvβ6-免疫脂质体(5-FU浓度为20mg/kg)。于注射后的不同时间点处死裸鼠,取裸鼠心、肝、脾、肺、肾以及肿瘤组织,高效液相色谱法分析5-FU在各组织中的浓度。3.选取肿瘤体积≥50mm3的结肠癌附瘤裸鼠,随机分成5个组,分别经尾静脉注射游离5-FU、5-FU-PEG-脂质体以及5-FU-抗αvβ6-免疫脂质体(5-FU浓度为20mg/kg),空载抗αvβ6-免疫脂质体和生理盐水作为对照组,每周注射2次,持续3周,期间测量裸鼠肿瘤体积和裸鼠体重。3周后,处死裸鼠,摘取肿瘤并称重。分析抗αvβ6-免疫脂质体的肿瘤抑制率和毒副作用。4.TUNEL实验检测各处理组裸鼠结肠癌移植瘤组织中细胞的凋亡情况。结果1.高效液相色谱法分析结果显示,在游离5-FU组,心、肝和肾脏组织中含有较高浓度的5-FU。对PEG-脂质体和抗αvβ6-免疫脂质体组,心、肝和肾脏组织中5-FU的浓度明显降低。在肿瘤组织中,PEG-脂质体和抗αvβ6-免疫脂质体组都含有较高浓度的5-FU,但是,随着时间的延长,抗αvβ6-免疫脂质体组5-FU的浓度逐渐升高,12小时后达到最大值,而PEG-脂质体组该浓度则逐渐降低。抗αvβ6-免疫脂质体组肿瘤组织浓度时间曲线下面积(AUC0-24)为 39.28±0.80μg/g*h,PEG-脂质体组的 AUC0_24 为10.42±0.62μg/g*h,组间差异有统计学意义。2.相对于游离5-FU组,5-FU-PEG-脂质体以及5-FU-抗αvβ6-免疫脂质体组能够显著抑制肿瘤的生长。然而,抗αv(36-免疫脂质体比PEG-脂质体史能够促进5-FU对肿瘤生长的抑制作用。相对应的,PEG-脂质体组的肿瘤重量是抗αvβ6-免疫脂质体组的3倍,各组差异有统计学意义。3.游离5-FU组中,裸鼠体重降低程度明显高于抗αvβ6-免疫脂质体组和PEG-脂质体组。4.TUNEL试验结果显示,相对于游离5-FU组,5-FU-PEG-脂质体,5-FU-抗αvβ6-免疫脂质体具有更高的肿瘤细胞凋亡率。结论本部分实验揭示,抗αvβ6-免疫脂质体能够促进所载药物在结肠癌组织聚积,从而提高化疗药物的抗肿瘤效果,同时,其又能够减少药物在心脏、肝脏以及肾脏等组织中的浓度,一定程度上降低了药物的对正常脏器的毒副作用。在抑制肿瘤方面,抗αvβ6-免疫脂质体载药后能有效抑制荷瘤体积的生长,并促进肿瘤细胞的凋亡。不仅如此,其对治疗裸鼠体重的影响较小,所以也反映出该靶向脂质体在控制药物副作用方面的优势。
[Abstract]:A long - circulation liposome is prepared by dispersing hydrophilic polyethylene glycol ( PEG ) on the surface of common liposome and improving its stability . In addition , the integrin 伪v尾6 has been used as a target for the treatment of colon cancer . The integrin 伪v尾6 has been used as a target for the treatment of colon cancer . The expression of integrin 伪v尾6 in colon cancer cell line HT - 29 and SW480 尾6 was significantly lower than that of untreated group ( untreated group ) and control group ( Con - siRNA ) . 5 - FU , 5 - FU - PEG - liposome and 5 - FU - anti - 伪v尾6 - immunoliposome ( 5 - FU concentration 20 mg / kg ) were injected into 5 - FU group , 5 - FU - PEG - liposome and 5 - FU - anti - 伪v尾6 - immunoliposome group .

【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.35

【参考文献】