间充质干细胞外泌体对蓝光损伤人视网膜色素上皮细胞及激光诱导大鼠脉络膜新生血管VEGF-A表达影响的研究
发布时间:2018-04-15 07:44
本文选题:外泌体 + 间充质干细胞 ; 参考:《天津医科大学》2017年博士论文
【摘要】:目的:观察人脐带间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,h UCMSCs)外泌体对蓝光损伤后人视网膜色素上皮(retina pigment epithelial,RPE)细胞及多波长激光诱导大鼠脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)A表达的影响。方法:1.h UCMSCs外泌体的提取与鉴定。培养人脐带间充质干细胞,收集上清液,采取梯度超速离心法分离纯化外泌体,透射电镜观察外泌体形态,蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测外泌体表面特异性标志蛋白CD63及h UCMSCs表面蛋白CD90表达。2.h UCMSCs外泌体对蓝光损伤后人RPE细胞VEGF-A表达的影响。取生长良好的人RPE细胞(ARPE-19),随机分为正常对照组,光损伤组和不同浓度及时间h UCMSCs外泌体处理组。运用蓝光(2000士500)lx照射ARPE-19细胞12h,建立光损伤模型,分别以25μg/ml,50μg/ml,75μg/ml的h UCMSCs外泌体处理蓝光损伤的RPE细胞8h,16h,24h。Western Blot及免疫荧光检测RPE细胞VEGF-A蛋白的表达,实时定量聚合酶链反应(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测RPE细胞VEGF-A m RNA的表达。3.h UCMSCs外泌体对多波长激光诱导大鼠CNV模型VEGF-A表达的影响。健康雄性灰色挪威(brown Norway,BN)大鼠90只随机分为正常对照组,模型组,不同浓度h UCMSCs外泌体处理组及生理盐水对照组,每组各15只。除正常对照组外各实验组以多波长氪红激光进行眼内光凝,围绕视盘光凝8个激光点,参数设置:波长:577nm,能量:200mw,光斑直径:100μm,曝光时间:0.1s。按照组别分别以1μl、2μl、3μl h UCMSCs外泌体及2μl生理盐水行玻璃体腔注射。饲养大鼠14,21天行眼底荧光血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)检测,各组间比较激光点渗漏情况.苏木素-伊红染色观察各组大鼠CNV组织学结构,免疫组织化学染色法观察各组别VEGF-A蛋白表达。结果:1.超速离心法成功提取h UCMSCs外泌体,电镜下显示外泌体为类圆形囊泡结构,直径为50-100nm,Western Blot检测h UCMSCs外泌体表面特异性蛋白CD63阳性。2.细胞学实验:光损伤组与正常对照组比较,VEGF-A蛋白及m RNA表达均显著提高(P0.05)。不同浓度h UCMSCs外泌体处理蓝光损伤的RPE细胞不同时间后,VEGF-A蛋白及m RNA表达均有下降,与损伤组对比有统计学差异(P0.05)。并且,随着h UCMSCs外泌体作用浓度及作用时间增强,光损伤RPE细胞VEGF-A蛋白及m RNA下调作用越强,差异有统计学意义(P0.05)。免疫荧光显示,相同作用时间随着h UCMSCs外泌体作用浓度提高,VEGF-A蛋白表达不断下降。3.动物学实验:不同剂量h UCMSCs外泌体处理激光诱导大鼠CNV模型,激光点渗漏明显减轻,与激光诱导组相比,差异有统计学意义(P0.05);且随注射剂量增加,改善渗漏效果越显著,差异有统计学意义(P0.05)。免疫组化染色显示,不同剂量h UCMSCs外泌体处理组VEGF-A蛋白表达下降,与激光诱导组相比,差异有统计学意义(P0.05);且随注射剂量增加,VEGF-A蛋白表达下降越显著,差异有统计学意义(P0.05)。HE染色显示随着h UCMSCs外泌体剂量增高,大鼠CNV结构改变逐渐减轻。结论:1.h UCMSCs上清液中利用梯度超速离心法能够提取出稳定剂量外泌体,经过表面特异性抗原检测,能证实其来源可靠。2.h UCMSCs外泌体能够有效降低蓝光诱导的人RPE细胞的VEGF-A表达,并与作用浓度和作用时间呈正相关。3.h UCMSCs外泌体能有有效改善激光诱导大鼠脉络膜新生血管模型渗漏及VEGF-A蛋白表达,且与药物剂量呈正相关。
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本文编号:1753195
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