猪溶血素在宿主脑膜炎和中毒性休克综合症过程中的作用机制研究

发布时间：2018-04-17 18:44

本文选题：猪溶血素 + 脑膜炎　；参考：《中国人民解放军军事医学科学院》2017年博士论文

【摘要】：猪链球菌被认为是一种重要的人畜共患病的病原菌。自1968年首次在丹麦发现并确认了人感染猪链球菌的病例后,四百多例猪链球菌散发感染在随后的四十多年中被陆续的报道出来,并且大部分的临床病症包括败血症,脑膜炎,心内膜炎,关节炎,肺炎等。脑膜炎患者在这些患者中的比例占到了70%以上,并且造成了一些死亡案例。之前中国两次大规模的猪链球菌疫情(1998年在江苏和2005年在四川)的爆发造成了两百多人的感染和53人死亡,几乎全部的死亡病例所表现出的症状为链球菌中毒性休克综合症。因此,对猪链球菌造成的这两种主要疾病的理解,有助于我们应对随时可能爆发的大规模的猪链球菌疫情并且有助于我们对持续不断的散发病例的防控与治疗。猪链球菌从最开始的感染到最后的致病,是多步骤的、复杂的,并且各种不同的毒力因子在不同的时空上发挥相应的作用。关于脑膜炎,因为之前的研究集中在猪链球菌与脑微血管内皮细胞的相互作用,以及猪链球菌引起脑实质的炎症反应上,所以我们的研究重点关注猪链球菌是如何穿过血脑屏障的这一问题,确认猪溶血素是否有助于猪链球菌穿过单层的人脑微血管内皮细胞组成的屏障;关于中毒性休克综合症,我们没有像之前的研究一样,把关注点放在爆发疫情的菌株新出现的89K毒力岛上,而是发现猪链球菌引起的中毒性休克综合症最主要的临床特征和血管渗漏有关,并且通过文献调研以及病人血清中肝素结合蛋白含量的测量,确认猪链球菌引起的血管渗漏与肝素结合蛋白有关,并且在猪链球菌中猪溶血素被确认是引起中性粒细胞释放肝素结合蛋白最主要的因素,本研究的关注点在于猪溶血素是通过什么样的机制引起肝素结合蛋白从中性粒细胞中释放并试图通过动物模型确认关键分子的作用。因而本论文从如下两个部分探讨猪溶血素在猪链球菌导致的两种主要疾病发病过程中的作用:在第一部分的研究中,为了验证猪链球菌是否能借助中性粒细胞的“改良的特洛伊木马”模型穿过血脑屏障,我们首先通过实时定量和酶联免疫吸附法对细菌和内皮细胞相互作用后细胞因子的基因水平和蛋白水平进行检测,发现由猪链球菌野生株05ZYH33敲除sly基因获得的Δsly敲除株不再能像野生株一样刺激细胞因子两种水平的表达,因而确认了猪溶血素是猪链球菌促使人脑微血管内皮细胞产生细胞因子的最主要毒力因子;接下来我们通过中性粒细胞穿过单层内皮屏障的体外transwell模型和感染猪链球菌的CD1小鼠大脑病理切片证实猪溶血素有助于中性粒细胞穿过血脑屏障到达脑组织,但猪链球菌野生株和敲除株在CD1小鼠血液和脑中的计数没有差异提示中性粒细胞穿过血脑屏障的过程中并没有通过“改进的特洛伊木马”模型帮助猪链球菌穿过血脑屏障。因此,猪链球菌在致脑膜炎的过程中,猪溶血素有助于中性粒细胞浸润等脑部炎症的发展,但并没有帮助猪链球菌穿过血脑屏障。在第二部分的研究中,为了确认猪溶血素引起中性粒细胞释放肝素结合蛋白的具体机制,我们通过流式的方法检测了猪溶血素刺激后中性粒细胞表面脱颗粒标志物的表达并通过酶联免疫吸附法检测了中性粒细胞颗粒内含物的释放,确认猪溶血素通过引起中性粒细胞脱颗粒的方式而非直接裂解细胞来释放肝素结合蛋白;接下来通过激光共聚焦检测中性粒细胞内钙离子含量,我们解释了由猪溶血素引起的中性粒细胞的肝素结合蛋白的释放是钙离子内流依赖性的;利用抑制剂途径的分析方式,我们认为猪溶血素会与中性粒细胞表面的TLR4受体结合,并激活下游p38 MAPK的磷酸化,从而激活核转录因子并促进ALOX5 mRNA的表达,转录合成5-脂加氧酶;5-脂加氧酶可以催化花生四烯酸转化为白三烯A4,经水解酶作用合成白三烯B4并分泌到细胞外;白三烯B4与中性粒细胞表面的G蛋白偶联受体BLT1结合,激活细胞内的PI3K通路从而导致中性粒细胞内的颗粒物向细胞膜表面移动,释放肝素结合蛋白;通过构建小鼠局部皮肤渗漏的Miles Assay模型,我们确认了猪溶血素能在体内实验中引起小鼠的血管渗漏。5-脂加氧酶的抑制剂Zileuton能显著的降低由猪溶血素引起的肝素结合蛋白的释放和小鼠的血管渗漏,证实了5-脂加氧酶在上述过程中起到了关键作用。我们的研究不仅阐释了由猪溶血素导致的中性粒细胞肝素结合蛋白的释放并引起血管渗漏的机制,丰富了由非A族链球菌引起的链球菌中毒性休克的理论,也有助于由猪链球菌引起的中毒性休克综合症的靶向治疗药物的研发,有助于未来猪链球菌疫情的防治工作。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R515

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