基于临床数据的舒筋蠲痹汤处方发现及其治疗类风湿关节炎作用机制研究

发布时间：2018-04-18 14:42

本文选题：类风湿关节炎 + 诊疗规律　；参考：《中国中医科学院》2017年博士论文

【摘要】：医生的诊疗经验是极其宝贵的财富,是关系中医继承、创新、发展的重要问题。随着科技发展,越来越多蕴含海量信息的His数据医院与日俱增,庞大的临床数据如何有效利用,对其蕴含的丰富临床资料和医生宝贵诊疗经验进行研究和总结,均是亟需解决的重要问题。全文旨在以杨卫彬主任医师的临床His数据分析为范例,对中医临床数据的应用及医生诊疗规律总结进行方法学层面的探讨。提出应用“跟诊学习与医院数据挖掘、网络药理学分子机制研究、模型动物机制验证”四位一体的模式来阐释中医临床诊疗规律,创新了中医诊疗规律总结方式和路径,为指导临床用药和新药研发提供重要参考。主要通过以下几个方面的工作进行展开:1.基于数据挖掘方法的中药治疗类风湿关节炎核心处方筛选目的:利用数据挖掘方法,以导师杨卫彬主任医师门诊His数据为例,研究其辨治类风湿关节炎的中医组方用药规律,并为研究医师治疗疾病经验总结进行方法学层面的探讨。方法:对中国中医科学院西苑医院风湿科杨卫彬主任4年来门诊His数据,利用中医传承辅助平台V2.5中集成的熵方法、改进的互信息等方法进行数据挖掘,对于其治疗类风湿关节炎的用药特色、配伍规律进行总结和挖掘,将其治疗类风湿关节炎经验凝练成核心处方。结果:1423个病例中,通过挖掘得到常用药物50个,主要包括祛风湿、温阳气、化瘀通络、清热通络、强筋骨,如麻黄、桂枝、防风、忍冬藤、当归、附子、怀牛膝等药物,常用的核心药物组合56个,如芍药-甘草,蜈蚣-僵蚕,忍冬藤-玄参-当归-甘草等。最终得到导师治疗类风湿关节炎的核心方——舒筋蠲痹汤。该处方核心组成为《金匮要略》治疗历节病名方,桂枝芍药知母汤与四妙勇安汤的合方的加减,舒筋蠲痹汤(桂枝、白芍、生甘草,麻黄,生姜,知母,防风,附子,金银花,玄参,当归,甘草,蜈蚣、僵蚕等)。本方较全面地照顾了类风湿关节炎风、寒、湿、瘀、虚各个病理环节。对于数据挖掘方法获得的核心处方,需要处方医生本人基于专业判断进行评价。导师认为该数据挖掘结果与临床应用情况高度一致,此种方法,可以客观地反应其学术规律,并且通过挖掘,使得可使临床经验、规律更好地凝练、更直观地展现。同时,导师临床验案,表明挖掘结果与临床规律一致性。2.核心处方优化及基于网络药理学的核心方治疗类风湿关节炎作用机制研究目的:1.在数据挖掘所得结果基础上,结合专家意见,参合网络药理学和药物临床应用,进一步进行处方优化。2.通过网络药理学方法,对优化后的核心方(舒筋蠲痹汤)治疗类风湿关节炎的作用机制初步探讨。方法:1.分别获取类风湿关节炎RA相关靶点和核心方汤药物潜在靶标。2.分别获取RA与核心方中单味药物重合基因,并依据重合基因的数量进行处方优化,最终确定优化的处方——舒筋蠲痹汤。3.对预测得到RA与舒筋蠲痹汤整体靶标,运用string软件构建Protein-Protein Interaction(PPI)蛋白质间相互作用网络。并将结果导入Cytoscape3.4.0进行拓扑结构值计算,获得核心的药物和靶点,并进行网络可视化展示。4.筛选得到的药物-疾病靶标在用DAVID软件(https://david.ncifcrf.gov/)进行功能注释生物信息学分析,富集KEGG通路并进行GO功能富集分析。5.对富集得到的 KEGG 通路(KEGG:Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes:http://www.kegg.jp/)。选择排名前8位的通路,对舒筋蠲痹汤治疗RA治疗机制做初步探讨。结果:预测得到与RA相关的基因共210个,与药物靶标963个。通过网络拓扑结构值计算,获得6个疾病-药物共同作用的核心蛋白:TNF-α,IFNG(IFN-y),IL1B(IL1-β),TP53,JUN,FOS。通过通路富集分析得到多条KEGG通路,包括类风湿关节炎通路,破骨细胞分化通路、肿瘤坏死因子信号通路、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路、MAPK信号通路、细胞因子受体相互作用、及NF-kappaB信号通路。包括类风湿关节炎通路,破骨细胞分化通路、肿瘤坏死因子信号通路等,其与发育、信号转导、免疫调节等相关。选取基因富集较多的破骨细胞分化通路进行研究,从抑制破骨细胞分化角度,对中药舒筋蠲痹汤对于类风湿关节炎的机制进行阐释。在下文中,我们选取TNF-α,IFNG(IFN-γ),IL1B(IL1-β),在模型动物血清中测定含量,对模型动物病变局部蛋白表量进行测定,如核蛋白c-Fos,c-Jun。IL-1和TNF-α,研究早已证明这两种细胞因子与RA发病有密切关系。其与RA在通常在RA患者关节滑液中显著升高,刺激结缔组织细胞和多形核细胞产生前列腺素等小分子炎症介质,通过刺激滑膜细胞和软骨细胞,使破骨细胞减少糖蛋白合成,增加糖蛋白降解,并产生胶原酶和其他中性蛋白酶,释放骨钙等,从而导致骨和软骨的破坏。而RA患者的滑膜细胞培养和滑膜细胞标本中c-Jun、C-Fos也增高。这些超表达现象集中反映了滑膜间质细胞的失调控和原位活化,导致血管翳象肿瘤样浸润使关节严重损伤。除预测得到的6个靶标外,为了更清晰说明舒筋蠲痹汤与破骨细胞分化的关系,进一步选取本通路上的其他关键蛋白,如Rank1、Tranf2、P38及其磷酸化表达的P-p38同时进行研究,以更好地明晰舒筋蠲痹汤治疗类风湿关节炎实现骨保护的作用机制。3.基于模型动物的舒筋蠲痹汤治疗机制验证目的:1.通过模型动物胶原诱导关节炎CIA大鼠,进行舒筋蠲痹汤的药效学研究。2.在药效学研究基础上,通过检测Osteoclast differentiation通路上8个蛋白表达量变化,进行舒筋蠲痹汤作用机制探讨。方法:根据网络药理学预测结果,选择基因富集较多的破骨细胞分化通路进行研究,并在动物模型上进行验证。选取国际研究RA公认模型,佐剂关节炎CIA大鼠模型,以中药舒筋蠲痹汤高、中、低三种剂量分别给予干预,以甲氨蝶呤为阳性对照药,主要药效学指标包括:踝关节肿胀度、关节评分、病理评分、特殊病理染色(针对破骨细胞特异性染色法,酒石酸酸性磷酸酶Trap法)、影像学(Micro-CT进行影像学角度进行骨破坏情况评估)等。与此同时对破骨细胞分化通路上通过预测得到的5个蛋白c-FOS,c-JUN,TNF-α,IFN-y,IL1-B进行验证,并在破骨细胞分化通路上另选多个关键蛋白,如Rank1、Traf2,P38等同时研究,运用Western blot,ELISA等方法研究局部组织和血液的蛋白表达水平变化。结果:通过动物实验以验证舒筋蠲痹汤对胶原诱导关节炎大鼠的治疗效果,结果显示舒筋蠲痹汤低、中剂量能有效减轻胶原诱导关节炎大鼠的关节肿胀程度及踝关节病理损坏程度。初步探讨了舒筋蠲痹汤对Osteoclast differentiation通路的调节作用,实验表明该方能够下调该通路上游的细胞因子IL1-1,TNF-α和IFN-y及中游的Traf2、p-p38,及下游核蛋白c-Jun,c-Fos的表达水平,从而控制炎症的发展及抑制破骨细胞分坏从而减少骨破坏的形成,为舒筋蠲痹汤治疗类风湿关节炎的分子生物学作用机制进行了初步验证,运用网络药理学与模型动物结合,为中药复方处方机理研究提供了新参考。创新点:本研究提出“跟诊学习与数据挖掘、网络药理学分子机制研究、模型动物机制验证”四位一体的模式来阐释中医诊疗规律,将跟诊高年资医生与基于数据挖掘的医院His数据临床规律总结、基于网络药理学的复方作用机制探讨与模型动物的机制验证等方式有机结合,创新了中医临床数据应用模式和诊疗规律研究模式。旨在通过传统中医临床经验总结方式与现代科研技术手段相结合的方式,为中医临床数据的利用从方法学层面进行探讨。从临床到科研,从宏观到微观,传统到新型,为临床数据利用和医生诊疗规律研究提供新思路、新方法。结论:“跟诊学习与His数据挖掘、网络药理学分子机制研究、模型动物机制验证”四位一体的模式,利于将宏观层面大数据背景下医师诊疗用药规律研究,与微观层面中药复方分子作用机理进行结合,立体地、多角度看待临床数据,对中医临床数据应用及诊疗规律的研究模式的探讨,便于更好地提炼临床医生诊疗特色、用药规律,对于指导临床用药和新药研发有参考意义。
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【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R259

【参考文献】