肝炎病毒感染调控肝癌增殖和转移作用和机制的研究

发布时间：2018-04-19 17:27

  本文选题：原发性肝细胞癌 + 肝炎病毒　； 参考：《第二军医大学》2017年博士论文

【摘要】：第一部分肝炎病毒感染调控肝癌增殖和转移作用和机制的研究:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是目前我国及世界范围内最为常见的恶性肿瘤之一,发生率在所有恶性肿瘤中居第五位,导致的死亡率在所有恶性肿瘤中排第三位。由于该病起病隐匿,早期没有症状或症状不十分明显,病程进展迅速,因此确诊时大多数患者已经达到中晚期或发生远处转移,治疗困难,导致预后差、病死率极高。目前肝癌的病因及确切分子机制尚不明确,普遍认为是一个多因素、多步骤的复杂过程,乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染是肝癌发生的最主要致病原因,约占到全部肝癌的70 85%。以往的研究表明感染有肝炎病毒的原发性肝癌患者的无瘤生存时间和整体生存时间均明显差于无病毒感染的原发性癌患者。通过我们科室前期的研究发现行肝部分切除术后存在普遍的病毒再激活现象,肝炎病毒再活化在肝癌的发展中起到了重要作用,并且能影响肝癌患者术后的复发和远期生存率。以往的研究表明肝癌术后持续的抗病毒治疗有望降低病毒载量,减轻肝脏炎症从而缓解肝脏负荷,降低晚期复发生存率和提高整体生存率从而达到改善肝癌术后预后的目的。我们前期的一项研究结果表明,抗病毒治疗没有起到直接发挥抗肿瘤作用,而是可以通过抑制肝炎病毒活性减轻肝脏慢性炎症,从而降低第二次原发肝癌发生的概率,而不能起到降低肝癌术后早期复发的作用。目前对于抗病毒治疗是否能够达到抗肿瘤的目的仍然存在争议,因此有必要明确病毒复制在肝癌复发中的作用机制,寻找病毒感染导致肝癌发生发展的特异性信号通路。本研究拟通过高通量测序手段识别肝炎病毒感染引起肝癌发生联系密切的基因和信号通路,进而明确肝炎病毒感染引起相关基因和信号通路发生变化的具体机制。接下来,我们将重点研究这些基因和信号通路通过怎样的调控方式来促进肝癌肿瘤细胞的增殖和转移。该研究不仅能够阐明病毒性肝炎感染导致肝癌发生发展的特异性机制,更能为未来的抗病毒治疗提供更多的个性化治疗方案。在本研究中首先通过高通量测序的手段检测正常肝脏组织、无病毒感染的原发肝癌组织、乙型肝炎病毒感染的原发肝癌组织、丙型肝炎病毒感染的原发肝癌组织中各组间转录本的表达水平,结合信息学分析筛选在病毒感染的原发肝癌组织中特异性差异表达的转录本,进一步系统、深入地揭示重要基因在病毒感染的肝癌发生发展中所扮演的角色,为肝癌的诊断和治疗以及合理的抗病毒治疗提供新的分子靶标和理论依据。在我们的课题研究中获得了如下结果:通过高通量测序和生物信息学分析,我们发现P54nrb在乙型肝炎病毒感染和丙型肝炎病毒感染的肝癌组织中异常高表达,暗示P54nrb在肝炎病毒感染调控肝癌发生和发展中发挥了重要的作用。通过免疫组化技术检测P54nrb蛋白在临床组织样本表达情况发现,P54nrb蛋白在肿瘤组织中的高表达量与有多个恶性的临床病理特征密切相关,P54nrb蛋白高表达的病人术后的无瘤生存时间和总体生存时间均较差,多因素分析显示P54nrb蛋白的高表达是影响肝癌病人肝癌切除术后预后的独立危险因素。体外细胞学实验发现P54nrb可以促进肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。利用裸鼠皮下成瘤模型、肝脏原位荷瘤模型、尾静脉注射肺定植模型,发现P54nrb既可促进肝癌细胞的体内增殖能力,又可促进肝癌细胞在远端转移灶的定植能力,也验证了P54nrb在肝癌发生发展中的重要作用。机制方面,通过生物信息学分析并结合已发表文献,发现转录因子Fox D3在P54nrb的启动子区域有潜在的结合位点,接下来我们利用染色质免疫共沉淀、定量PCR、蛋白免疫印迹、双荧光素酶报告基因检测等技术证明Fox D3可直接靶向结合到的P54nrb的启动子区域进而抑制P54nrb的转录。进一步临床组织样本分析发现Fox D3的表达量与P54nrb恰好相反,在病毒感染肿瘤组织中异常低表达。由此我们推测病毒感染导致肿瘤中Fox D3的表达量下降从而导致了P54nrb的异常高表达。近年来有文献报道证明Fox D3在肿瘤组织中异常低表达的原因与其启动子区域受到甲基化调控密切相关。通过甲基化特异性荧光定量法检测发现Fox D3启动子区域的甲基化程度在病毒感染的肿瘤组织中特异性的升高,揭示了Fox D3在病毒感染的肿瘤组织中特异性降低与甲基化密切相关。DNA甲基转移酶1是DNA进行复制修复并维持其正常甲基化的关键酶,DNMT1过表达在肿瘤的发生中扮演着重要的角色,但是DNMT1是否在病毒感染的肿瘤组织中调控Fox D3启动子区域的甲基化程度从而介导Fox D3的表达尚不清楚。通过RT-PCR、蛋白免疫印迹、以及甲基化特异性荧光定量法检测,我们发现DNMT1的表达量与病毒感染密切相关,并且DNMT1确实可以调控Fox D3启动子区域的甲基化程度。Hbx蛋白和HCV core蛋白在肝癌发生发展中发挥着重要的生物学作用,可以调控多个重要基因的转录表达。在我们的研究中鉴定出Hbx蛋白和HCV core蛋白可以促进DNMT1的转录从而上调DNMT1的表达。由此我们得出肝炎病毒分泌的Hbx蛋白/HCV core蛋白通过上调DNMT1的表达从而增强了Fox D3的甲基化程度进而抑制了Fox D3的表达从而导致了P54nrb上调最终达到促进肝癌发生发展的级联效应。接下来我们探索了P54nrb促进肝癌增殖和转移的分子学机制,利用表达谱芯片、Ch IP-seq、生物信息学分析、和经典分子生物学技术等,验证得出P54nrb可以结合到N-Ras基因的启动子的活化区域并且促进N-Ras基因的转录,从而活化RAF/ERK/MEK信号通路来发挥促进肝癌增殖和转移的作用。最后我们通过对2组临床病人的组织检测接受抗病毒治疗前后DNMT1/Fox D3/P54nrb/N-Ras表达量的检测得出抗病毒治疗能够翻转该信号通路的表达量,由此我们推测抗病毒治疗可能通过抑制该信号通路的活化来抑制肿瘤的发生和发展从而达到一定抗肿瘤的作用。综上所述,我们研究了病毒感染对促进肝癌发生发展,特别是对有特殊基因参与的表观遗传调控的作用的分子机制进行了深入而广泛的探讨,为进一步理解该过程中纷繁复杂的信号通路提供了新的思路和视角,为肝癌的抗病毒治疗提供了新的思路。第二部分TMED3通过IL-11/STAT3信号通路促进原发性肝细胞癌进展的机制研究:肝癌是全世界最为常见的恶性肿瘤之一,其发病率在世界范围内的恶性肿瘤中位居第五位,而死亡率则占肿瘤相关死亡更是高居第三位。随着外科切除、肝移植以及部分辅助疗法的成熟,肝癌五年生存率有了一定程度的提高。但是,肝细胞癌术后复发,肝内、外转移的风险仍较大。由于肝癌起病隐匿,早期没有症状或症状不十分明显、病程进展迅速,因此确诊时大部分病人诊断时既为中晚期,同时更因为血管癌栓、子灶、包膜不全和多中心发生等情况的存在,缺乏有效的治疗,术后仍有很高的复发转移率,造成了肝癌预后依然很差。因此,需要全面了解肝癌复发与转移的分子生物学机制,探索新的更加有效的治疗方法,寻找对预后和治疗有指导意义的分子标志物。有文献报道TMED3在结肠癌中能够抑制肿瘤的侵袭和转移,然而TMED3在原发性肝癌中的表达情况和生物学功能国内外尚未见有系统报道。因此我们的研究旨在为深入了解TMED3在肝癌恶性进展过程中的生物学作用和分子学机制,为临床肝癌治疗提供新的、潜在治疗靶点。通过Real-Time PCR和免疫组化技术检测发现TMED3在肿瘤组织中的表达量明显高于癌旁组织,并且我们发现TMED3的高表达与有侵袭性的临床病理特征密切相关,TMED3高表达的病人术后的无瘤生存时间(RFS,P=0.0128)和总体生存时间(OS,P=0.0155)都明显低于TMED3低表达的病人,多因素分析显示TMED3高表达是影响肝癌病人术后预后的独立危险因素。体外细胞学实验证实,TMED3能够显著的促进肝癌细胞侵袭和转移能力,但是对于细胞的增殖能力没有任何影响。裸鼠体内实验证实TMED3对肝癌细胞体内成瘤没有影响,可以促进肝癌细胞转移到肺部成瘤能力。接下来我们利用表达谱芯片和一系列的分子学实验发现TMED3上调IL-11的表达、诱导IL-11的自分泌、活化IL-11/STAT3信号通路。总之,我们通过对大规模肝癌临床样本分析,发现TMED3的表达与病人预后显著相关;机制方面,我们发现TMED3通过影响IL-11/STAT3信号通路调控肝癌的侵袭和转移;我们的研究发现了一个潜在的肝癌治疗靶点,为肝癌治疗提供了新的思路。
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本文编号：1774033