动脉内移植预处理的骨髓间充质干细胞治疗犬脑梗死的研究

发布时间：2018-04-23 17:40

  本文选题：脑梗死 + 骨髓间充质干细胞　； 参考：《南京医科大学》2017年博士论文

【摘要】：脑梗死为临床常见疾病,是由于神经细胞的缺血耐受性和再生能力差,其致残率和死亡率高,多年来其临床治疗方法法无根本性的进展,给家庭和社会造成了沉重的负担。干细胞治疗近年来发展迅速,已涉及多种不同领域,为多种难治性疾病,如帕金森、阿尔兹海默症、糖尿病等带来了新的希望。近年来随着干细胞研究和组织工程的发展,特别是成体干细胞具有自我复制和多向分化潜能的发现,同时其具有取材方便和符合伦理学等特点,使其成为进展最迅速的一个领域。许多动物实验表明应用干细胞移植治疗脑梗死能够促进神经细胞再生和修复,明显改善实验动物的预后,已经开始进行的少量临床试验也证实了其可行性和安全性。然而,随着越来越多的研究证实移植的干细胞到达损伤脑组织的数量很少,存活的时间较短而且长期存活的比例极低,也没有充分的证据表明干细胞转化为自体神经细胞及建立神经突触联系。实验研究发现在应用干细胞治疗心肌、肝及肾脏疾病时,单纯移植干细组植干细基同样有较样的治疗效果,并且避免了细胞移植造成的一些并发症,从而提出了旁分泌假说。本研究第一部分,通过分离、培养和鉴定犬骨髓来源成体干细胞,建立稳定的犬骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)系,并鉴定它们的干细胞特性。通过缺氧预处理BMSCs与粒细胞集落刺激因子(G-CSF)共培养,增强其增殖、迁移及神经分化能力。本研究第二部分,通过慢病毒转染BMSCs,使其过表达目的基因,并研究其在超顺磁氧化铁纳米颗粒(Superparamagnetic Iron Oxide,SPIO)标记后细胞功能及级神经分化能力。在研究的第三部分,通过血栓弹力图及体外磁共振检测不同比例血液成分构成血栓,明确不同血栓成分其血栓强度与磁共振信号变化对应关系。在研究的第四部分,通过改良犬自体血栓构建犬脑梗列模型,并由颈内动脉途径注射基因修饰干细胞并对其进行影像学评估,研究基因修饰后BMSCs对脑梗死的修复作用并探讨其可能的作用机制。本研究为BMSCs在神经修复领域积累了实验研究资料,揭示了其对脑梗死治疗的可能性。 、缺氧预处理联合粒细胞集落刺激因子对犬骨髓间充质干细胞的作用研究1分离、培养和鉴定犬骨髓间充质干细胞穿刺抽取犬肱骨上段骨髓液,采用密度梯度离心法分离犬骨髓间充质干细胞(BMSCs),通过贴壁法纯化培养至P2,流式细胞分析BMSCs不表达CD34,CD45,表达CD44,CD90等间充质干细胞表面抗原。BMSCs具有多向分化潜能,经一定诱导,可在体外向中胚层细胞系,如成骨、成脂胞分化。BMSCs在体外易于扩展培养且可在不同代次冷冻保存,在液氮中冷冻12个月后复苏,对干细胞增殖能力基本无影响,可继续培养或用于进一步研究。2缺氧预处理BMSCs与粒细胞集落测激因子共培养细胞功能与神经分化能力检测取P3 BMSCs于低氧培养箱,以1%氧浓度作为缺氧处理氧浓度,以6h、12h及24h作为缺氧处理时间,通过CCK-8检测缺氧处理后细胞增殖能力,Transwell试验检测缺氧处理后细胞迁移能力,结果表明缺氧预处理12h组干细胞增殖、迁移能力高于其他组别(P0.05)。其后以12h作为缺氧预处理时间,以常氧组作为对照组,对BMSCs进行体外神经定向诱导分化,结果表明缺氧组神经分化率高于常氧组(68.5%±5.3%v.s.54.3%±7.4%,P0.05),real-time PCR 检测相关神经 marker MAP-2、NF-L 明显高于常氧组,细胞迁移能力HH相关细胞因子CXCR-4表达量亦明显高于常氧组(P0.05)。粒细胞集落刺激因子可进一步促进缺氧预处理后BMSCs的增殖迁移能力。二、基因修饰、SPIO标记犬骨髓间充质干细胞后的神经分化能力检测1 慢病毒转染BMSCs构建稳定高表达目的基因细胞系采用逐孔稀释法复核病毒滴度,以不同稀释倍数稀释病毒液并转染P3BMSCs,转染后通过Guava Express analysis软件分析绿色荧光表达量,并通过cell counting kit-8(CCK-8)检测细胞活力,以明确慢病毒对犬BSMCs的亲嗜性,并确定最佳复感染指数(multiplicity of infection,MOI值),本研究明确了MOI=10时,BMSCs具有佳绿色荧光蛋白表达率及细胞活力值。通过real-time PCR检测目的基因BDNF(brain-derived neurotrophic factor)表达含量明显增高。慢病毒对BMSCs具有较优秀的亲嗜性,可构建稳定的高表达BDNF细胞系。2 BDNF-BMSCs体外SPIO标记及神经诱导分化分别以不同浓度SPIO体外标记犬BMSCs,通过结合标记效率指标普鲁士蓝染色及台盼蓝检测细胞毒性,明确SPIO浓度于20μg/mL时,BMSCs具有良好的标记率及低细胞毒性。在一定条件下对BDNF-SPIO-BMSCs进行诱导分化,可见BMSCs细胞形态上首先出现神经样改变,兔疫荧光及real-time PRC可检测神经Marker Nestin,GFAP,TUJ1等表达量明显高于对照组,同时目的基因亦有明显高表达。三、不同成分血栓的血栓弹力图检测及体外磁共振成像研究1不同成分犬血样进行血栓弹力图检测以穿刺针分别穿刺犬股动静脉,通过5F鞘抽取动静脉全血,以4000r/min离心10min,分层后吸取上清层及中间薄膜层。以动脉全血、静脉全血、动脉上清+薄膜层(动脉上清组)及静脉血清 +薄膜层(静脉上清组)分组,分别检测其血栓弹力图(TEG),血常规及病理学HE染色。结果证实:犬全血相比人类相对高凝,上清组血栓形成速率低于全血组,全血组MA值均明显高于上清组(P0.001),而静脉上清组MA值高于动脉上清组(P=0.041),表明全血制作血栓其血栓强度可能优于上清组,而静脉上清组制作的血栓其血栓强度可能优于动脉上清组。2不同成分犬血制作血栓进行体外影像学及病理学检测以上述组别血液成分静置于1.8ml冻存管2h制作血栓分组,以碘油及水作为对照组,置于含明胶溶剂为媒介的塑料器皿中,通过螺旋3T磁共振体外扫描。结果证实上清组血栓信号稳定,且T2WI信号值明显高于全血组,上清组间静脉组略高于动脉组(364±17,358±20),但无统计学差异(P0.05)。病理学检测证实,全血组以红细胞为著,布满视野,而上清组红细胞显著减少,并可见纤维蛋白,与血常规检测相符。综合分析,静脉上清制作血栓信号稳定,血栓强度优于动脉组,血栓成分中,随红细胞比例增加,T2WI信号值减低。四、动脉内移植基因修饰的骨髓间充质干细胞治疗犬脑梗死的研究1.犬大脑中动脉栓塞联合颈内动脉近端血流阻断建立脑梗死模型及其影像学评估采用改良Seldinger技术穿刺右侧股动脉置入5F导管鞘。经股动脉鞘引入5F椎动脉导管,超选至颈内动脉上升段约2cm。分别将1.4mm、1.7mm直径血栓放入装有对比剂(欧乃派克300)的2ml注射器中将血栓注入导管,并给以间断性压力缓慢注射,分别栓塞大脑中动脉远端及M1段的近端,完成相对大面积脑梗死建模。脑梗建模后6小时进行T2WI,可初次在栓塞大脑中动脉供血区域见到异常高信号,随时间进展,脑梗病灶范围变小,界限变清晰(图5)。建模24小时后,校正后平均脑梗死体积为4173.23± 603.92mm3。模型建立后7天平局脑梗死为3273.21 ± 616.05 mm3,其体积较建模24小时校正后脑梗体积明显减小(P0.01)。2 SPIO-BMSCs经动脉途径移植影像学示踪研究以20μg/mLSPIO进行犬BMSCs、BDNF-BMSCs标记后,经犬颈内动脉注射1×106数量级干细胞,通过磁共振对比分析两组干细胞在移植前、移植后不同时间点(1小时、24小时、1周、2周、3周、4周)在梗死灶示踪状况。结果示标记细胞在3.0TMRIT2*WI和SWI序列上信号减低最明显。随标记后培养时间延长,SPIO标记率及信号强度均下降,体外MRI仅可示踪到4周左右,两组间无明显差异。3经动脉途径移植基因修饰干细胞治疗犬脑梗死建模1周后将18只比格犬随机分为3组:BDNF+组(A组),BDNF-组(B组)及空白对照组(C组),各组脑梗体积分别为:3166.10±487.77、3292.05±518.62、3204.80±359.37,组间脑梗体积无统计学差异(P0.05)。随时间推移不同组别脑梗体积呈现不同程度下降,移植组(A、B组)于移植后第二周脑梗体积明显低于未移植组,表明细胞移植组疗效优于未移植组(C组),第四周A组梗死体积明显低于B组,表明BDNF+BMSCs疗效优于BDNF-组,即单纯BMSCs组。建模1周后各组犬神经系统评分分别为:4.50±0.75、4.37±1.18、4.87±0.64,组间脑梗体积无统计学差异(P0.05)。随时间推移不同组别犬神经系统评分呈现不同程度下降,细胞移植后第一周起,移植组(A、B组)犬神经功能评分显著低于未移植组(C组),P=0.004;多重比较显示A、B组组间无统计学差异,P0.05。细胞移植后第二周起,A组犬神经功能评分明显低于B组(2.37±0.51,2.87±0.35,P=0.037);至移植后第四周,犬神经功能评分分别为1.62±0.51、2.12±0.35、2.75±0.46(P0.001)。结论本研究成功分离、培养了犬骨髓间充质干细胞(BMSCs),明确了缺氧处理可增强BMSCs的体外增殖、迁移能力以及神经分化潜能,说明了 BMSCs比较适于适应缺氧环境,同时其神经分化潜能的增强更有力的证明了其在体内缺氧环境(脑梗死灶)发挥替代作用的可能性。经过慢病毒转染与SPIO标记,BMSCs成功过表达目的基因BDNF,其神经分化能力进一步提高。以犬改良自体血栓构建脑梗死为基础,证实BDNF-BMSCs的移植可进一步减低梗死面积,改善脑梗预后。
[Abstract]:In the third part of the study , we found that the transplantation of stem cells to treat cerebral infarction can promote the regeneration and repair of neural cells , improve the prognosis of experimental animals . ,缂烘哀棰勫�勭悊鑱斿悎绮掔粏鑳為泦钀藉埡婵�鍥犲瓙瀵圭姮楠ㄩ珦闂村厖璐ㄥ共缁嗚優鐨勪綔鐢ㄧ爺绌，

本文编号：1792954