MicroRNA-200c靶向上皮间质转化调节因子ZEB2抑制非小细胞肺癌的转移

发布时间：2018-04-26 00:17

本文选题：非小细胞肺癌 + MicroRNA-200c　；参考：《山东大学》2017年博士论文

【摘要】：研究背景肺癌是癌症相关死亡的主要原因之一,且发病率有逐年升高的趋势,其90%的死亡原因与肿瘤转移影响重要脏器功能有关。越来越多的研究表明肿瘤的侵袭转移与MicroRNA(miRNA)的表达失调有关。上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是分化的上皮细胞转化为去分化、具有迁徙能力的间充质样细胞的过程。一些能够启动EMT发生的信号通路在转录和转录后水平激活EMT转录因子(EMT transcription factor,EMT-TF)并触发EMT。EMT-TF包括三个家族:锌指SNAIL(Snail 1和Snail2/Slug)、锌指E盒子结合同源框(ZEB1和ZEB2/SIP1)和碱性螺旋-环-螺旋转录因子(Twist1,Twist2 和 E12/E47)。ZEB2是重要的EMT-TF之一,它通过抑制细胞角蛋白、E-cadherin、巨噬细胞功能相关抗原-1、桥粒蛋白和黏蛋白的转录,促进EMT的发生。miR-200家族能够与ZEB1/ZEB2 mRNA3'-UTR上的多个位点结合,导致ZEB1/ZEB2 mRNA的破坏,逆转EMT。作为miR-200家族重要成员之一的miR-200c被广泛研究,但发现其表达和功能在不同的肿瘤中表现不同。miR-200c在胃癌、肝癌、肾透明细胞癌等肿瘤中低表达,具有肿瘤抑制剂作用;而在卵巢癌、膀胱癌、子宫内膜癌等肿瘤中高表达,发挥致癌作用。目前关于miR-200c在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达水平、调节机制及其与NSCLC临床病理特征之间的相关性也存在争议。有研究发现miR-200c在NSCLC组织中上调表达,miR-200c的高表达与NSCLC患者的低生存率相关。也有研究发现miR-200c在NSCLC肿瘤组织中下调表达,并且其表达水平与肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移、E-cadherin表达情况及病理类型等有关。我们检测NSCLC组织标本及多种NSCLC细胞株中的miR-200c的表达量,并通过体外实验验证miR-200c的生物学功能,以期阐明miR-200c在NSCLC中的表达和功能。目前认为miR-200c通过两大类途径调节EMT:一是通过调节ZEB1/2/E-cadherin轴抑制EMT发生,二是通过ZEB1/2以外的靶点抑制EMT发生。有研究表明miR-200c的表达降低常伴随ZEB1/2的表达增加,并通过下调E-cadherin促进EMT的发生。这一调节通路已在胃癌、胰腺癌、乳腺癌等肿瘤中被证实,但miR-200c在NSCLC中的作用机制有待进一步研究。研究目的探讨miR-200c在NSCLC肿瘤组织和细胞株中的表达情况,研究miR-200c对NSCLC细胞迁移、侵袭能力的影响及其靶向ZEB2/E-cadherin轴的调节机制。为明确miR-200c在NSCLC细胞中的功能奠定理论基础,为NSCLC的诊断和有效治疗方案的研究提供理论依据。研究方法1.miR-200c与ZEB2在NSCLC组织中的表达及其相关性采用实时定量 PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测 39 对 NSCLC肿瘤组织及其配对的邻近正常肺组织标本中miR-200c及ZEB2的表达水平。统计分析两者在NSCLC组织中表达趋势和相关性,以及miR-200c与年龄、性别、肿瘤病理类型、肿瘤分化程度、肿瘤大小、肿瘤局部分期(T)、淋巴结转移、远处转移、肿瘤TNM分期等临床病理特征之间的相关性。2.miR-200c在NSCLC细胞株中的表达及对侵袭转移能力的影响采用qRT-PCR方法检测NSCLC细胞株A549、H358、H460和H1229中miR-200c的表达水平与正常人肺上皮细胞(BEAS-2B)的差异,选取差异最明显的一组作为研究对象。将miR-200c类似物、竞争性类似物分别转染至A549细胞中,qRT-PCR方法检测转染后A549细胞miR-200c的表达量,细胞迁移实验和细胞侵袭实验观察各组细胞的增殖、迁移和侵袭情况。3.miR-200c靶向ZEB2抑制NSCLC A549细胞株的侵袭转移能力双荧光素酶报告基因实验检测miR-200c是否直接结合于非小细胞肺癌A549细胞ZEB2的3'-UTR核心序列;将miR-200c类似物和miR-200c抑制剂转染至A549细胞,上调和下调miR-200c,测定A549细胞中ZEB2蛋白水平是否随着miR-200c表达水平的变化而变化;将ZEB2 siRNA转染至A549细胞,抑制ZEB2的蛋白表达,细胞迁移实验和细胞侵袭实验测定细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化,观察该变化是否与上调miR-200c一致。上调或下调miR-200c后,利用Western blot方法检测A549细胞中EMT标记物N-cadherin、E-cadherin和Vimentin的表达变化,观察miR-200c对EMT相关蛋白的影响。研究结果1.qRT-PCR方法检测39对NSCLC肿瘤组织及配对邻近正常组织标本中miR-200c、ZEB2的表达水平,结果显示miR-200c在肿瘤组织中下调表达(P0.05),ZEB2在肿瘤组织中上调表达(P0.05),两者的表达呈负相关(P0.05)。miR-200c表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移数量、TNM分期负相关(P0.05),与年龄、性别、病理类型、肿瘤分化程度、T分期、远处转移无显著相关。2.qRT-PCR方法检测BEAS-2B及4种NSCLC细胞株中miR-200c表达水平。结果显示,BEAS-2B 的 miR-200c 表达量为单位 1,A549、H358、H460 和 H1229细胞株miR-200c相对表达量分别为:0.24、0.51、0.76、0.39,表明miR-200c在各NSCLC细胞株中显著下调表达(P0.05),在A549细胞株中下调表达最明显。3.qRT-PCR方法检测转染miR-200c类似物对A549细胞株miR-200c表达的影响。结果显示,正常对照组(Control)miR-200c表达量为单位1,转染miR-200c类似物组miR-200c相对表达量为7.30,阴性对照组(Negative control,NC)为0.95,证实转染miR-200c类似物后miR-200c表达显著增加(P0.05)。细胞迁徙实验和侵袭实验验证上调miR-200c对细胞侵袭转移能力的影响。设细胞迁徙试验最初划痕宽度为单位1,经过48小时培养后,Control、NC、转染miR-200c类似物组相对划痕宽度分别为0.66、0.61、0.89,证明转染miR-200c类似物组细胞增殖、迁徙能力下降(P0.05)。细胞侵袭实验结果显示,Control组、NC组、转染miR-200c类似物组侵袭过膜的A549细胞数分别为100个/视野、95个/视野、35个/视野,证明转染miR-200c类似物组细胞迁移、侵袭能力下降(P0.05)。以上实验证明上调miR-200c能够抑制A549细胞的迁移侵袭能力。4.制备ZEB2的3'-UTR的野生型和突变型表达质粒pMIR-ZEB2和pMIR-Mut ZEB2。共转染pMIR-ZEB2和miR-200c类似物的A549细胞中荧光素酶活性为].25;共转染pMIR-Mut ZEB2和miR-200c类似物组、Control组、NC组的荧光素酶活性均在2.70-2.80之间,差异有统计学意义(P0.01),证实在NSCLC A549细胞中miR-200c核心序列能够直接与ZEB2 mRNA3'-UTR碱基序列结合,ZEB2是miR-200c的直接靶点。5.qRT-PCR方法检测转染miR-200c类似物和抑制剂对A549细胞株miR-200c表达量的影响。结果显示,Control组miR-200c表达量为单位1,转染miR-200c类似物组、转染miR-200c抑制剂组miR-200c相对表达量分别为7.30、0.30,证明转染miR-200c类似物后miR-200c表达量增加,转染miR-200c抑制剂miR-200c表达量下降,差异均有统计学意义(P0.05)。Western blot方法测定上调或下调miR-200c后A549细胞中ZEB2蛋白水平。设Control组ZEB2表达量为单位1,则转染miR-200c类似物组、转染miR-200c抑制剂组ZEB2相对表达量为0.23、1.6,说明上调miR-200c能显著抑制ZEB2表达(P0.05),而下调miR-200c能诱导ZEB2蛋白表达显著增加(P0.05)。证明miR-200c与ZEB2的确存在靶向调节关系,并且两者呈负向调节关系。6.Western blot方法检测转染ZEB2 siRNA后的ZEB2表达水平。设Control组ZEB2蛋白表达量为单位1,则NC组、转染ZEB2 siRNA组ZEB2相对表达量分别为0.95、0.14,证明转染ZEB2 siRNA导致A549细胞ZEB2蛋白表达水平显著下降(P0.05)。细胞迁徙实验和侵袭实验验证下调ZEB2对细胞侵袭转移能力的影响。细胞迁移实验结果中设Control组、NC组、转染ZEB2 siRNA组划痕宽度为单位1,培养48小时后各组相对划痕宽度分别为0.61、0.63、0.82,相对于两个对照组,转染ZEB2 siRNA组A549细胞的增殖和迁徙能力显著降低(P0.05)。细胞侵袭实验结果显示,Control组和NC组过膜细胞数约为150个/视野,而转染ZEB2 siRNA组约为40个/视野,差异有统计学意义(P0.05),说明该组细胞迁徙侵袭能力降低。细胞迁移实验和细胞侵袭实验均证明下调ZEB2表达抑制了 A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力。这与上调miR-200c表达所致结果一致。7.Western blot方法检测上调或下调miR-200c后EMT标记物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 的表达水平。分别设对照组中 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达量为单位1,则转染miR-200c类似物组三者的相对表达量分别为2.10、0.28、0.22,三者的前后变化差异有统计学意义(P0.05),可见过表达miR-200c能够上调E-cadherin表达,下调N-cadherin和Vimentin表达。与之相反,转染miR-200c抑制剂组三者的相对表达量分别为0.53、1.56、1.5,差异有统计学意义(P0.05),说明降低miR-200c能够下调E-cadherin、上调N-cadherin、Vimentin 表达。由此证明 miR-200c 通过 ZEB2/E-cadherin 影响 EMT从而抑制肿瘤侵袭转移。结论1.miR-200c在NSCLC肿瘤组织中显著下调表达,ZEB2上调表达,两者间负相关;miR-200c表达水平与肿瘤TNM分期、淋巴结转移数量、肿瘤大小呈负相关性,与年龄、性别、病理类型、肿瘤分化程度、T分期、远处转移无显著相关。miR-200c有可能成为NSCLC诊断和监测疾病进展的生物标记物。2.miR-200c在NSCLC细胞株A549、H358、H460和H1229中显著下调表达,在A549细胞株中下调表达最明显。上调miR-200c能够抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭,进一步验证了临床样本中的研究结果。证实miR-200c具有肿瘤抑制剂的作用,可能成为抑制NSCLC侵袭转移的治疗靶点。3.miR-200c在NSCLC A549细胞中直接靶向ZEB2抑制肿瘤的增殖、迁移和侵袭。miR-200c 的表达变化能够影响 EMT 标记物:E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达,证实miR-200c通过ZEB2/E-cadherin轴调控EMT,这有助于深入理解NSCLC侵袭转移的发生机制,为研发新的抗肿瘤药物提供理论依据。创新性1.首次证实在NSCLC肿瘤组织标本中,miR-200c下调表达,ZEB2上调表达,两者的表达负相关。进一步分析发现miR-200c表达水平与NSCLC肿瘤大小、淋巴结转移数量、TNM分期负相关,与年龄、性别、病理类型、肿瘤分化程度、T分期、远处转移无显著相关。2.首次证实miR-200c在NSCLC A549细胞中直接靶向抑制ZEB2,从而影响EMT相关蛋白变化,降低肿瘤的增殖、迁移和侵袭能力。证实在NSCLC中miR-200c和ZEB2之间呈负调节关系。意义1.本研究证实了 miR-200c在NSCLC肿瘤组织和细胞系中下调表达;miR-200c的表达水平与NSCLC肿瘤大小、淋巴结转移数量、TNM分期负相关,推论miR-200c有可能成为NSCLC诊断和监测疾病进展的标记物。2.本研究发现miR-200c表达水平越低,肿瘤越具有侵袭转移倾向。进一步研究发现,在A549细胞株中上调miR-200c能够降低肿瘤的侵袭转移能力,提示miR-200c具有肿瘤抑制剂作用,有可能成为抗肿瘤新药。3.本研究发现在NSCLC肿瘤组织中miR-200c和ZEB2间存在负相关性;在NSCLC A549细胞中进一步证实miR-200c能够通过ZEB2/E-cadherin轴抑制EMT,降低肿瘤的侵袭转移能力,这有助于深入理解NSCLC侵袭转移的发生机制,为开发抗肿瘤新药提供理论依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

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