定量检测TAA自身抗体方法的建立及其在肝癌血清学诊断中的价值

发布时间：2016-11-19 03:47

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《郑州大学》 2015年

定量检测TAA自身抗体方法的建立及其在肝癌血清学诊断中的价值

任鹏飞  

【摘要】：目的和意义肿瘤相关抗原(tumor associated antigen, TAA)自身抗体是一类具有早期诊断肝癌潜力的肿瘤标志物,发现具有理想诊断价值的TAA自身抗体指标对肝癌诊断有重要意义。然而通过高通量筛选技术识别的候选TAA自身抗体数以千记,必须经过人群血清的验证才能从中鉴定出有较高诊断价值的指标。而作为血清学验证最为广泛使用的ELISA方法,却难以对新发现的自身抗体指标进行定量检测,不同批次的检测结果可比性差,限制了TAA自身抗体鉴定和评价工作的快速开展。因此,本研究的目的是在建立TAA自身抗体定量检测技术的基础上,从高通量筛选技术获得的候选TAA.自身抗体中鉴定出具有较高诊断价值的指标,同时联合现有的TAA自身抗体指标,筛选出对肝癌具有较高诊断价值的组合。为TAA自身抗体作为诊断肝癌的血清学方法向临床应用转化奠定基础。研究方法1.使用基因工程技术制备18种候选TAAs或TAAs。(1)对尚未获得表达质粒的目的蛋白构建重组质粒：将目的基因分别插入到表达载体pET-28a(+)质粒中。(2)构建目的蛋白的原核表达系统：分别将重组表达质粒转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21中,构建原核表达系统。然后优化IPTG诱导浓度,确定重组蛋白的可溶性。(3)目的蛋白的表达与纯化：采用组氨酸标签蛋白纯化方案纯化13种组氨酸标签蛋白(包括NPM1、14-3-3 (?) MDM2、p53、Koc、IMP1、AHSG、FTL、 c-Myc、Survivin、Ra1A、HCC1.4、p62), GST标签蛋白纯化方案纯化5种GST标签蛋白(包括p16、Cyclin E、Cyclin B1、Cyclin D1、p90)。2.建立TAA.自身抗体标准化的定量ELISA检测方法。(1)确定开发定量检测方法的TAA自身抗体指标：使用传统ELISA方法初步鉴定10种候选TAA自身抗体,识别出可能有诊断价值的TAA自身抗体指标。结合前期研究已确定的另外13种TAA自身抗体,确定拟开发定量检测方法的TAA自身抗体种类。(2)建立每种TAA自身抗体的阳性标准品和阴性标准品：使用传统ELISA方法和Western blot方法分别为每种自身抗体获得一批强阳性血清、阴性血清。(3)采用棋盘滴定法优化每种TAA自身抗体ELISA检测时的关键反应参数。(4)在参数优化的工作基础上,建立TAA自身抗体定量方法。1)根据IgG结构的特点及Fc段与葡萄球菌白蛋白A特异结合的特性,提出IgG型自身抗体定量原理。2)测定定量标准品(人IgG)饱和包被浓度和定量标准曲线的线性范围。3)分别尝试使用Bardfrod法和直接ELISA法测定系列定量标准品在酶标板上的实际吸附量。4)通过多次重复试验,观察定量标准曲线的稳定性。3.评价多种TAA自身抗体在肝癌诊断中的价值。(1)使用本文建立的定量ELISA检测方法检测97例原发性肝细胞癌患者、83例肝硬化患者、89例慢性肝炎患者和104例正常人血清的TAA自身抗体浓度。(2)确定各种TAA自身抗体指标的截断值：分别使用均数加3倍标准差、ROC曲线和第95百分位数(P95)作为截断值,观察肝癌组、肝硬化组、慢性肝炎组和正常人的阳性率情况,选择出合适的截断值判断方法。(3)以慢性肝炎和肝硬化患者为对照,评价联合检测多种TAA自身抗体对肝癌的诊断价值。1)使用并联策略联合多种TAA自身抗体指标,优化出对肝癌诊断有较高价值的组合。2)以二分类非条件Logistic回归模型作为联合策略,将多个自身抗体指标作为自变量,建立肝癌诊断的预测模型,ROC曲线评价预测模型对肝癌的诊断价值。(4)分析联合检测对AFP阴性肝癌患者的诊断价值。计算联合检测对AFP阴性肝癌患者的检出率,联合检测结合AFP对肝癌患者检出率提高的程度。结果1.成功构建NPM1、14-3-3 (?) MDM2三种重组蛋白的原核表达系统,建立起NPM1、14-3-3 (?) MDM2和p90四种重组蛋白的大量制备技术,成功纯化到18种候选TAAs或TAAs的重组蛋白。2.成功建立起IgG型TAA自身抗体标准化的定量检测方法。(1)从10种候选TAAs自身抗体中初步鉴定出6种(NMP1、MDM2、14-3-3(?) p90、HCC1.4、FH)指标可能对肝癌诊断有价值,而PBP、GLUD1、NDRG1和PRDX1可能对肝癌的诊断无价值。结合既往已确定的多种TAA自身抗体,选择18种指标开发定量ELISA检测技术。(2)从18种指标中获得16种TAA自身抗体的阳性标准品和阴性标准品,优化出每一种自身抗体ELISA检测的关键反应参数。(3)成功测出定量标准品IgG的线性包被浓度范围为0～300ng/ml;并测定各个浓度定标品的实际吸附质量；确定了定量标准品吸附于酶标板后稳定存在,吸附量不被干扰条件影响。3.16种TAA自身抗体在肝癌诊断中的价值评价结果。(1)对于16种TAA自身抗体的截断值判定,以慢性肝病组(包含慢性肝炎患者和肝硬化患者)的第95百分位数作为截断值最为适宜。(2)两种联合策略中并联检测有更高的敏感性：并联14种TAA自身抗体检测肝癌的灵敏度可提高到82.5%,特异度为79.7%；而使用构建Logistic回归预测模型的联合方式,共筛选出8种TAA自身抗体进入回归方程,采用ROC曲线法确定的最佳临界点作为截断值时,检测的灵敏度可提高到70.8%,特异度为73.8%。(3)并联检测多种TAA自身抗体对AFP阴性肝癌患者具有重要意义：对于本研究中涉及的29例AFP阴性的肝癌患者,有26例(89.7%)并联检测结果阳性；对于87例既有AFP检测又有TAA自身抗体检测的肝癌患者,AFP结合并联检测的阳性检出率为96.6%(84/87)。结论1.建立了一种IgG型TAA自身抗体通用的ELISA定量检测方法,在方法学上为候选TAA抗体的鉴定和评价工作提供了一种较好的手段。2.联合检测多种TAA自身抗体能够有效提高诊断肝癌的价值,通过不断优化组合有望成为一种有效诊断肝癌的血清学方法。

【关键词】：
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

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