基于SIRT1信号通路的人参皂苷Rb2和Rg2预处理对心肌损伤的保护作用及机制研究

发布时间：2018-04-29 08:25

  本文选题：人参皂苷Rb2 + 人参皂苷Rg2　； 参考：《吉林大学》2017年博士论文

【摘要】：本研究运用细胞模型(体外培养H2O2诱导H9c2心肌细胞损伤模型)和动物模型(在体大鼠心肌缺血再灌注损伤动物模型),观察人参皂苷Rb2和Rg2预处理对心肌细胞氧化性损伤和心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其分子机制。主要研究如下:一、基于SIRT1信号通路的人参皂苷Rb2预处理对心肌损伤的保护作用及机制研究1.人参皂苷Rb2预处理对H2O2损伤H9c2心肌细胞的保护作用研究方法:采用人参皂苷Rb2(1、3、10μg/mL)预处理4 h,再加入H202150 μM作用6 h,观察人参皂苷Rb2对H2O2诱导心肌细胞凋亡的影响。应用MTT法检测细胞存活率;荧光倒置显微镜观察心肌细胞生长状态和DAPI染色后细胞形态;分光光度法检测细胞培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)活性,心肌细胞的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性和丙二醛(MDA)含量;流式细胞术检测心肌细胞内活性氧(ROS)的水平;Annexin V/PI双染检测细胞凋亡情况;蛋白免疫印记(Western Blot)检测心肌细胞Procaspase-3、Procaspase-9、Bcl-2、Bax 和 SIRT1 蛋白表达情况。研究结果:H9c2心肌细胞经人参皂昔Rb2(1、3、10μg/mL)预处理4h,再加入H2O2 150 μM作用6h,与Model组比较,人参皂苷Rb2(1、3、10μg/mL)预处理均可提高心肌细胞存活率(P0.01);人参皂苷Rb2(1、3、10μg/mL)预处理后均能不同程度减轻H202诱导的H9c2细胞损伤,可使心肌细胞伪足回缩减轻,空泡数量减少,悬浮细胞明显减少;人参皂苷Rb2预处理可明显降低H2O2损伤H9c2心肌细胞LDH漏出率,降低MDA含量,升高SOD、GSH-PX活性,减少ROS的产生(P0.05或P0.01),提示其能明显增强H9c2心肌细胞的抗氧化能力;经DAPI染色后荧光倒置显微镜观察发现,人参皂苷Rb2预处理后能明显减少凋亡细胞数量,且呈剂量依赖关系;AnnexinV/PI染色后流式细胞术检测,人参皂苷Rb2(1、3、10 μg/mL)预处理后均能明显降低心肌细胞凋亡率(P0.01);Western Blot检测发现人参皂苷Rb2(1、3、10 μg/mL)预处理后抑制心肌细胞Procaspase-3和Procaspase-9的剪切活化,上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达,并且Bcl-2/Bax的比例也随药物浓度的增加而升高;Western Blot检测发现人参皂苷Rb2(1、3、10μg/mL)预处理后可使心肌细胞SIRT1蛋白表达明显增多(P0.01)。2.人参皂苷Rb2预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究方法:将Wistar大鼠随机分为Sham组、MI/R组、人参皂苷Rb2(10、20mg/kg)剂量组和Diltiazem组。结扎大鼠冠状动脉左前降支,缺血30min,再灌注6 h,每组取部分大鼠检测心肌梗死面积、血液生化学、心肌细胞凋亡、组织病理学等相关指标,剩余大鼠再灌注72 h,评价心脏功能,观察人参皂苷Rb2预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响。应用彩色多普勒超声便携机检测大鼠心脏功能;测定心肌梗死面积;利用自动生化分析仪测定血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)及LDH活性;分光光度法检测心肌组织中SOD、GSH-PX、过氧化氢酶(CAT)活性和MDA含量;QPCR检测心肌组织中促炎性细胞因子相关基因表达水平;观察心肌组织HE染色及电镜超微结构;TUNEL法检测心肌组织凋亡;免疫组织化学方法检测大鼠心肌组织中 SIRT1 蛋白表达水平;Western Blot 检测心肌组织 Procaspase-3、Procaspase-9、Bax和Bcl-2蛋白表达,检测心肌组织SIRTl/p53、PI3K/Akt通路中相关蛋白的表达及其磷酸化水平。研究结果:人参皂昔Rb2 10、20 mg/kg均能使MI/R大鼠LVIDd、LVIDs减少,同时增加LVEF、LVFS,说明人参皂苷Rb2预处理可明显改善心肌缺血再灌注损伤大鼠的心功能;与MI/R组比较,人参皂苷Rb2 10、20mg/kg均可明显减小大鼠MIS(P0.05或P0.01),降低大鼠血清中CK-MB、AST和LDH活性(P0.05或P0.01),并能降低心肌组织中MD A含量,升高SOD、CAT和GSH-PX活性(P0.01),降低心肌组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平(P0.05或P0.01),减轻MI/R大鼠心肌组织的病理学损伤改变,明显降低心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡指数(P0.01)。Western Blot检测发现,人参皂苷Rb2抑制Procaspase-3和Procaspase-9的剪切活化,上调Bcl-2蛋白表达水平,下调Bax蛋白表达水平;人参皂苷Rb2预处理可明显上调MI/R大鼠心肌组织SIRT1的蛋白表达,下调A-p53的蛋白表达,提示其抗心肌缺血再灌注损伤作用与激活SIRT1和使p53去乙酰化有关;人参皂苷Rb2可明显上调MI/R大鼠心肌组织中PI3K、Akt和eNOS的磷酸化水平,提示其抗心肌缺血再灌注损伤作用与激活PI3K/Akt/eNOS信号通路有关。3.基于SIRT1信号通路的人参皂苷Rb2预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用及机制研究研究方法:将Wistar大鼠随机分为MI/R组、MI/R+Rb2组、MI/R+Rb2+EX527(SIRT1信号通路抑制剂)组和MI/R+EX527组,给予相应药物后制备MI/R模型。结扎大鼠冠状动脉左前降支,缺血30 min,再灌注6 h,每组取部分大鼠检测心肌梗死面积、血液生化学、心肌细胞凋亡、组织病理学等相关指标,剩余大鼠再灌注72 h,评价心脏功能。应用彩色多普勒超声便携机检测大鼠心脏功能;测定心肌梗死面积;利用自动生化分析仪测定血清心肌三酶活性;分光光度法检测心肌组织中SOD、GSH-PX、CAT活性和MDA含量;QPCR检测心肌组织中促炎性细胞因子相关基因表达水平;观察心肌组织HE染色及电镜超微结构;TUNEL法检测心肌组织凋亡;免疫组织化学方法检测大鼠心肌组织中SIRT1蛋白表达水平;Western Blot 检测心肌组织 Procaspase-3、Procaspase-9、Bax 和 Bcl-2蛋白表达,检测心肌组织SIRT1/p53、PI3K/Akt通路中相关蛋白的表达及其磷酸化水平。研究结果:人参皂苷Rb2预处理可明显改善MI/R大鼠心功能,减小心肌梗死面积,降低血清心肌三酶活性,改善心肌组织损伤的病理学变化,而EX527可以拮抗人参皂苷Rb2的作用;人参皂昔Rb2预处理可明显增加大鼠心肌组织SOD、CAT和GSH-PX活性,降低MDA含量,而EX527可以拮抗人参皂苷Rb2的抗氧化应激损伤作用;人参皂苷Rb2可明显降低心肌组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平,抑制炎症反应的发生,而EX527可以拮抗人参皂苷Rb2的作用;人参皂苷Rb2预处理可明显降低MI/R大鼠心肌细胞凋亡指数,抑制Procaspase-3和Procaspase-9的剪切活化,上调Bcl-2蛋白表达水平,下调Bax蛋白表达水平,而EX527可以拮抗人参皂苷Rb2的作用;人参皂苷Rb2预处理可明显上调MI/R大鼠心肌组织SIRT1的蛋白表达,下调A-p53的蛋白表达,而EX527可以拮抗人参皂苷Rb2的作用;人参皂苷Rb2可明显上调MI/R大鼠心肌组织中PI3K、Akt和eNOS的磷酸化水平,而EX527可以拮抗人参皂苷Rb2的作用。二、基于SIRT1信号通路的人参皂苷Rg2预处理对心肌损伤的保护作用及机制研究1.人参皂苷Rg2预处理对H2O2损伤H9c2心肌细胞的保护作用研究方法:采用人参皂苷Rg2(1、3、10μg/mL)预处理4h,再加入H202150μM作用6 h,观察人参皂苷Rg2对H2O2诱导心肌细胞凋亡的影响。应用MTT法检测细胞存活率;荧光倒置显微镜观察心肌细胞生长状态和DAPI染色后细胞形态;分光光度法检测细胞培养上清中LDH活性,测定心肌细胞SOD、GSH-PX活性和MDA含量;流式细胞术检测心肌细胞内ROS水平;AnnexinV/PI双染检测细胞凋亡情况;Western Blot 检测心肌细胞 Procaspase-3、Procaspase-9、Bcl-2、Bax和SIRT1蛋白表达情况。研究结果:H9c2心肌细胞经人参皂苷Rg2(1、3、10μμg/mL)预处理4h,再加入H2O2150 μ作用6 h,与Model组比较,人参皂苷Rg2(1、3、10μg/mL)预处理可提高心肌细胞存活率(P0.01);人参皂苷Rg2(1、3、10μg/mL)预处理后均能不同程度减轻H2O2所致的H9c2细胞损伤,可使心肌细胞伪足回缩减轻,空泡数量减少,悬浮细胞明显减少;人参皂苷Rg2预处理可明显降低H2O2损伤H9c2心肌细胞LDH漏出率,降低MDA含量,升高SOD和GSH-PX活性,减少ROS的产生(P0.05或P0.01),提示其能明显增强H9c2心肌细胞的抗氧化能力;经DAPI染色后荧光倒置显微镜观察,人参皂苷Rg2预处理后能明显减少凋亡细胞数量,且呈剂量依赖关系;AnnexinV/PI染色后流式细胞术检测,人参皂苷Rg2预处理后均能明显降低心肌细胞凋亡率;Western Blot检测发现人参阜苷 Rg2(1、3、10 μg/mL)预处理可抑制 Procaspase-3 和 Procaspase-9 的剪切活化,上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达,并且Bcl-2/Bax的比例也随药物浓度的增加而升高;Western Blot检测发现,人参皂苷Rg2(1、3、10 μg/mL)预处理后可使心肌细胞SIRT1蛋白表达明显增多(P0.01)。2.人参皂苷Rg2预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究方法:将Wistar大鼠随机分为Sham组、MI/R组、人参皂苷Rg2(10、20mg/kg)剂量组和Diltiazem组。结扎大鼠冠状动脉左前降支,缺血30min,再灌注6 h,每组取部分大鼠检测心肌梗死面积、血液生化学、心肌细胞凋亡、组织病理学等相关指标,剩余大鼠再灌注72 h,评价心脏功能,观察人参皂苷Rg2对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响。应用彩色多普勒超声便携机检测心脏功能;测定心肌梗死面积;利用自动生化分析仪测定CK-MB、AST及LDH活性;分光光度法检测心肌组织中SOD、GSH-PX、CAT活性和MDA含量;QPCR检测心肌组织中促炎性细胞因子相关基因表达水平;观察心肌组织HE染色及电镜超微结构;TUNEL法检测心肌组织凋亡;免疫组织化学方法检测大鼠心肌组织中 SIRT1 蛋白表达水平;Western Blot 检测心肌组织 Procaspase-3、Procaspase-9、Bax和Bcl-2蛋白表达,检测心肌组织SIRT1/p53、PI3K/Akt通路中相关蛋白的表达及其磷酸化水平。研究结果:人参皂苷Rg2 10、20 mg/kg均能使MI/R大鼠LVIDd、LVIDs减少,同时增加LVEF、LVFS,说明人参皂苷Rg2预处理可明显改善MI/R大鼠的心功能;与MI/R组比较,人参皂苷Rg2 10、20mg/kg均可明显减小大鼠MIS(P0.05或P0.01),降低大鼠血清中CK-MB、AST和LDH活性(P0.05或P0.01),降低心肌组织中MDA含量,升高SOD、CAT和GSH-PX活性(P0.01),降低心肌组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平(P0.05或P0.01),减轻MI/R大鼠心肌组织的病理学损伤改变,明显降低心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡指数(P0.01)。Western Blot检测发现,人参皂昔Rg2可制Procaspase-3和Procaspase-9的剪切活化,上调Bcl-2蛋白表达水平,下调Bax蛋白表达水平;人参皂苷Rg2预处理可明显上调MI/R大鼠心肌组织SIRT1的蛋白表达,下调A-p53的蛋白表达,提示其抗心肌缺血再灌注损伤作用与激活SIRT1和使p53去乙酰化有关;人参皂苷Rg2可明显上调MI/R大鼠心肌组织中PI3K、Akt和eNOS蛋白的磷酸化水平,提示其抗心肌缺血再灌注损伤作用与激活PI3K/Akt/eNOS信号通路有关。3.基于SIRT1信号通路的人参皂苷Rg2对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用及机制研究研究方法:将Wistar大鼠随机分为MI/R组、MI/R+Rg2组、MI/R+Rg2+EX527组和MI/R+EX527组。结扎大鼠冠状动脉左前降支,缺血30min,再灌注6h,每组取部分大鼠检测心肌梗死面积、血液生化学、心肌细胞凋亡和组织病理学等相关指标,剩余大鼠再灌注72h,评价心脏功能。检测大鼠心脏功能;测定心肌梗死面积;利用自动生化分析仪测定血清心肌三酶活性;分光光度法检测心肌组织中SOD、GSH-PX、CAT活性和MDA含量;QPCR检测心肌组织中促炎性细胞因子相关基因表达水平;观察心肌组织HE染色及电镜超微结构;TUNEL法检测心肌组织凋亡;免疫组织化学方法检测大鼠心肌组织中SIRT1蛋白表达水平;Western Blot 检测心肌组织 Procaspase-3、Procaspase-9、Bax 和 Bcl-2 蛋白表达,检测心肌组织SIRT1/p53、PI3K/Akt通路中相关蛋白的表达及其磷酸化水平。研究结果:人参皂苷Rg2预处理可明显改善MI/R大鼠心功能,减小心肌梗死面积,降低血清心肌三酶活性,改善心肌组织损伤的病理学变化,而EX527可以拮抗人参皂苷Rg2的作用;人参皂苷Rg2预处理可明显增加大鼠心肌组织SOD、CAT和GSH-PX活性,降低MDA含量,而EX527可以拮抗人参皂苷Rg2的抗氧化应激损伤作用;人参皂苷Rg2可明显降低心肌组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平,抑制炎症反应,而EX527可以拮抗人参皂苷Rg2的作用;人参皂苷Rg2预处理可明显降低MI/R大鼠心肌细胞凋亡指数,抑制Procaspase-3和Procaspase-9的剪切活化,上调Bcl-2蛋白表达水平,下调Bax蛋白表达水平,而EX527可以拮抗人参皂苷Rg2的作用;人参皂苷Rg2预处理可明显上调MI/R大鼠心肌组织SIRT1的蛋白表达,下调A-p53的蛋白表达,而EX527可以拮抗人参皂苷Rb2的作用;人参皂苷Rb2可明显上调MI/R大鼠心肌组织中PI3K、Akt和eNOS蛋白的磷酸化水平,而EX527可以拮抗人参皂昔Rg2的作用。本研究从细胞水平和整体动物水平上,证实了人参皂苷Rb2和Rg2预处理对H2O2诱导心肌细胞损伤和心肌缺血再灌注损伤均具有保护作用,并初步阐述了其作用机制。人参皂苷Rb2和Rg2预处理均通过激活SIRT1,活化PI3K/Akt信号通路,对大鼠心肌缺血再灌注损伤起保护作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
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本文编号：1819157