沉默BMI-1、RNF2基因对食管鳞癌细胞放射敏感性的影响

发布时间：2018-04-29 11:49

本文选题：BMI-1 + RNF2　；参考：《河北医科大学》2017年博士论文

【摘要】：第一部分BMI-1、RNF2基因在食管鳞癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系目的:食管鳞状细胞癌(esohaphageal squamous cell carcinoma,ESCC)是严重威胁人类生命及健康的癌症之一。放疗是中晚期食管鳞癌患者重要的治疗方法,然而,由于放射抵抗性的存在,部分患者的预后仍很差。B细胞特异性莫洛尼鼠白血病病毒插入位点-1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site-1,BMI-1)和环指蛋白2(RING finger protein,RNF2)均属于多梳基因家族(polycomb group,Pc G)成员,在多种恶性肿瘤中高表达,本文旨在通过检测BMI-1和RNF2在ESCC组织及相应癌旁正常粘膜组织中的表达变化,分析其与患者临床病理特征及术后生存时间的关系。方法:1采用免疫组织化学技术检测人食管鳞癌组织及相应癌旁正常粘膜组织中BMI-1和RNF2的表达。2通过Western blotting方法检测人食管鳞癌组织及相应癌旁正常粘膜组织中BMI-1和RNF2蛋白的表达水平。3分析BMI-1和RNF2表达与患者临床病理特征及预后的关系。结果:1免疫组织化学方法检测BMI-1和RNF2表达变化免疫组织化学分析结果显示,BMI-1和RNF2蛋白主要定位于肿瘤细胞的细胞核。60例食管鳞癌组织中,BMI-1阳性表达32例,表达率为53.33%;60例相应癌旁正常粘膜组织中,BMI-1蛋白阳性表达5例,表达率为8.33%。64例食管鳞癌组织中,RNF2蛋白阳性表达35例,表达率为54.69%;64例相应癌旁正常粘膜组织中,RNF2蛋白阳性表达7例,表达率为10.94%。统计学分析发现,癌组织中BMI-1、RNF2蛋白的表达水平明显高于相应的癌旁正常粘膜组织(P0.001)。Western blotting检测124例食管鳞癌患者癌组织内BMI-1、RNF2蛋白表达情况,结果显示与癌旁正常粘膜组织相比,食管鳞癌组织内BMI-1、RNF2蛋白表达量均明显高于癌旁正常粘膜组织中的表达量,分别为0.317±0.098 vs 1.032±0.210、0.206±0.028 vs 1.070±0.153,且差异具有统计学意义(P0.05),与免疫组化的检测结果一致。3 BMI-1、RNF2与食管鳞癌患者的临床病理参数及预后的关系食管鳞癌组织中BMI-1、RNF2蛋白的表达高低与肿瘤大小(P=0.022,P=0.024)、淋巴结转移(P=0.011,P=0.015)及TNM分期(P=0.021,P=0.027)密切相关,与患者年龄、性别、组织学分级等参数的差异均未见统计学意义(P0.05);Kaplan-Meier生存分析结果显示,BMI-1、RNF2阳性表达者的总生存率明显低于阴性表达者,差异具有统计学意义(P0.001);BMI-1阳性表达者和阴性表达者的3年生存率分别为18.80%和58.30%,中位生存时间分别为14个月和26个月。RNF2阳性表达者和阴性表达者的3年生存率分别为14.30%和48.30%,中位生存时间分别为15个月和24个月。结论:1在人食管鳞癌组织中BMI-1和RNF2蛋白高表达。2 BMI-1和RNF2在食管鳞癌组织中的表达水平与肿瘤恶性程度、淋巴结转移及患者不良预后有关,为食管鳞癌患者分子靶向治疗提供新思路。第二部分沉默BMI-1、RNF2基因对体外食管鳞癌细胞放射敏感性的影响目的:通过靶向沉默BMI-1和RNF2基因,研究BMI-1和RNF2蛋白表达对食管鳞癌细胞X线照射后的增殖水平、迁移能力、细胞周期分布及凋亡等生物学特性的影响及与DNA损伤修复基因的关系,探讨BMI-1和RNF2对食管鳞癌细胞放射敏感性的调控。方法:1采用Western blotting方法检测人食管鳞癌细胞系TE13、KYSE30、ECA109和KYSE170中BMI-1和RNF2蛋白的表达水平。2构建敲低BMI-1和RNF2的真核表达载体(p GLV3-H1-BMI-1和p GLV3-H1-RNF2),分别转染食管鳞癌ECA109和TE13细胞株,用嘌2 Western blotting检测BMI-1和RNF2的蛋白表达变化呤霉素进行筛选,挑取单克隆扩大培养后获得稳定BMI-1和RNF2低表达的ECA109-sh BMI-1(ECA109-sh RNF2)和TE13-sh BMI-1(TE13-sh RNF2)细胞及各自阴性对照的ECA109-NC和TE13-NC细胞。分别采用q RT-PCR和Western blotting方法检测BMI-1和RNF2基因的沉默效率。3分别采用MTS法和克隆形成实验检测沉默BMI-1和RNF2基因表达后对食管鳞癌细胞增殖水平和放射敏感性的影响。4采用Transwell迁移实验检测沉默BMI-1和RNF2基因表达后对食管鳞癌细胞迁移能力的影响。5应用Western blotting法检测BMI-1、RNF2及其下游γH2AX和H2AK119ub在不同食管鳞癌细胞系中随照射时间和照射剂量的变化情况;采用激光共聚焦检测上述蛋白在细胞核内斑点随照射时间和照射剂量变化的分布。采用免疫共沉淀方法检测BMI-1、RNF2与γH2AX、H2AK119ub之间的关系。6采用流式细胞技术检测沉默BMI-1和RNF2基因表达后对各组食管鳞癌细胞周期分布及细胞凋亡的影响。7采用Western blotting方法检测细胞周期相关蛋白(CDK4、Cycle D2、P16)和细胞凋亡相关蛋白(bcl-2、bax)的表达。结果:1 BMI-1和RNF2在不同食管鳞癌细胞系中的表达Western blotting检测结果显示,BMI-1和RNF2蛋白在4种食管鳞癌细胞系TE13、KYSE30、ECA109和KYSE170中均有不同程度的表达。其中,BMI-1和RNF2蛋白在ECA109和TE13细胞系中的表达量相对较高(P0.01)。2 BMI-1 sh RNA和RNF2 sh RNA转染食管鳞癌细胞沉默效果为了检测BMI-1和RNF2对食管鳞癌放射敏感性的影响,选择BMI-1和RNF2表达量相对较高的ECA109和TE13细胞株进行基因沉默。q RT-PCR和Western blotting检测结果显示,与ECA109-control、ECA109-NC细胞相比,ECA109-sh BMI-1细胞中BMI-1 m RNA和蛋白的表达水平明显降低(P0.01)。同样,TE13-sh BMI-1细胞中BMI-1 m RNA和蛋白的表达水平明显低于TE13-control、TE13-NC细胞(P0.01)。RNF2m RNA和蛋白在ECA109和TE13细胞中的表达情况与BMI-1结果一致。上述结果表明,稳定转染BMI-1 sh RNA和RNF2 sh RNA均有效抑制了BMI-1和RNF2基因在ECA109和TE13细胞中的表达。3沉默BMI-1和RNF2对食管鳞癌细胞增殖水平和克隆形成的影响MTS检测发现,未行X线照射时,细胞培养24h、48h、72h后,转染BMI-1 sh RNA或转染RNF2 sh RNA的ECA109和TE13细胞的吸光度值均显著低于各自control、NC组,差异均具有统计学意义(P0.05),照射后48h、72h这种趋势更明显(P0.01)。克隆形成实验显示,BMI-1sh RNA和RNF2 sh RNA组细胞的D0、Dq、SF2值均明显低于control与NC组,外推数N值显著高于control与NC组(P0.05)。control与NC组细胞放射敏感性的差异未见统计学意义(P0.05),而BMI-1 sh RNA和RNF2 sh RNA组细胞的放射敏感性明显高于control与NC组(P0.05)。4沉默BMI-1和RNF2对食管鳞癌细胞迁移能力的影响Transwell迁移实验结果显示,各组细胞培养24h后,穿过基底膜的ECA109-BMI-1 sh RNA和ECA109-RNF2 sh RNA组细胞数明显低于穿过基底膜的control与NC组细胞数(P0.05)。此外,穿过基底膜的TE13-BMI-1 sh RNA和TE13-RNF2 sh RNA组细胞数也明显低于穿过基底膜的control与NC组细胞数(P0.05)。5 BMI-1、RNF2与DNA损伤修复基因的关系Western blotting检测结果显示,BMI-1、RNF2与H2AK119ub、γH2AX蛋白随着照射剂量的增加而增加,在6Gy照射后1~2h三种蛋白表达量最高,随后逐渐下降,24h接近照射前水平,三种蛋白的变化趋势一致,存在时间依赖性和剂量依赖性。激光共聚焦结果显示,γH2AX与BMI-1、RNF2在细胞核内的斑点数量随着照射剂量的增加而增加;此外,在6Gy照射后1~2h核内斑点达到峰值,随后逐渐减少,24h接近照射前水平,三者随照射剂量和照射后时间变化的规律基本一致。免疫共沉淀结果显示,照射前BMI-1、RNF2蛋白的表达与H2AK119ub、γH2AX蛋白表达未见明显相关性,而照射后H2AK119ub、γH2AX表达均与BMI-1、RNF2蛋白表达密切相关。6沉默BMI-1和RNF2对照射前、后食管鳞癌细胞周期分布的影响未照射时各组细胞的细胞周期中各期比例的差异均未见统计学意义(P0.05)。而照射后各组G0/G1期细胞比例均较照射前明显减低(P0.05),且BMI-1 sh RNA、RNF2 sh RNA组G0/G1期细胞比例明显高于control与NC组(P0.01);照射后各组G2/M期细胞比例均明显高于相应未照射组(P0.05),且照射后BMI-1 sh RNA、RNF2 sh RNA组G2/M期细胞比例明显低于control与NC组(P0.01)。照射前、后各组处于S期细胞比例的差异均未见统计学意义(P0.05)。7沉默BMI-1和RNF2基因对照射前、后食管鳞癌细胞凋亡的影响结果显示,照射后各组细胞凋亡率均明显高于相应未照射组(P0.05)。照射前BMI-1 sh RNA组细胞凋亡率较control与NC组高,但差异未见统计学意义(P0.05),照射后BMI-1 sh RNA组细胞凋亡率明显高于control与NC组(P0.01);照射前,RNF2 sh RNA组细胞凋亡率显著高于control和NC组,差异具有统计学意义(P0.05),照射后这种趋势更明显(P0.01)。8沉默BMI-1和RNF2基因对食管鳞癌细胞周期相关蛋白、凋亡相关蛋白的影响1)沉默BMI-1和RNF2基因对照射前、后食管鳞癌细胞表达Cyclin D2、CDK4、P16的影响Western blotting结果显示,照射后各组细胞中Cyclin D2、CDK4、P16蛋白表达明显高于相应未照射组(P0.05)。与control和NC组相比,照射前BMI-1 sh RNA和RNF2 sh RNA组细胞中Cyclin D2、CDK4蛋白的表达水平显著降低,而P16蛋白的表达水平明显升高(P0.05),照射后这种趋势更明显(P0.01)。2)沉默BMI-1和RNF2基因对照射前、后食管鳞癌细胞表达bcl-2、bax的影响研究结果显示,照射后各组细胞中bcl-2、bax蛋白表达明显高于相应未照射组(P0.05);与control与NC组相比,照射前BMI-1 sh RNA和RNF2 sh RNA组bcl-2蛋白的表达水平显著下降,而bax蛋白的表达水平明显上升,差异具有统计学意义(P0.05),照射后这种趋势更明显更明显(P0.01)。结论:1沉默BMI-1和RNF2基因表达可将食管鳞癌细胞周期阻滞于G0/G1期,诱导了肿瘤细胞的凋亡,从而有效抑制了食管鳞癌细胞的增殖水平和迁移能力,促进了食管鳞癌细胞的放射敏感性。2 BMI-1和RNF2对细胞周期分布和细胞凋亡的调控通过与H2AK119ub、γH2AX相互作用以调节细胞周期相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达来实现。第三部分沉默BMI-1、RNF2基因对人食管鳞癌细胞裸鼠移植瘤体内放射增敏效应的观察目的:建立裸鼠移植瘤模型观察BMI-1和RNF2基因沉默后食管鳞癌细胞在裸鼠体内的成瘤效应,并分析其分子改变,以探讨BMI-1和RNF2在食管鳞癌发生发展中的作用机制。方法:1分别以TE13-control、TE13-p GLV3-H1、TE13-BMI-1 sh RNA和TE13-RNF2 sh RNA细胞接种BALB/c/nu裸鼠,建立裸鼠移植瘤模型,观察裸鼠成瘤及皮下肿瘤生长情况。2在裸鼠移植瘤长至直径约为0.8~1.0cm时照射裸鼠,照射后24 h处死,Western blotting法检测肿瘤组织内BMI-1和RNF2蛋白的表达。3 TUNEL方法检测各组荷瘤裸鼠肿瘤组织的凋亡情况。4免疫组织化学方法检测各组荷瘤裸鼠肿瘤组织中BMI-1、RNF2及凋亡相关蛋白bcl-2、bax的表达。结果:1沉默BMI-1和RNF2基因对肿瘤成瘤和移植瘤生长抑制的影响观察后发现,NC组对裸鼠移植瘤的生长未见显著影响,而沉默BMI-1或RNF2基因后,裸鼠移植瘤生长缓慢,肿瘤体积较小,与control、NC组相比,差异具有统计学意义(P0.05),照射后这种趋势更明显。control与NC组裸鼠移植瘤生长速度最快,沉默BMI-1或RNF2后移植瘤生长速度减慢,照射后移植瘤生长速度更慢,差异具有统计学意义(P0.05)。NC组、NC+照射组、BMI-1 sh RNA组、BMI-1 sh RNA+照射组、RNF2 sh RNA组、RNF2 sh RNA+照射组移植瘤的生长抑制率分别为:8.22%、52.52%、29.71%、76.26%、33.42%、75.73%,沉默BMI-1或RNF2联合照射组裸鼠肿瘤的体积、重量均明显减低,表明采用RNA干扰技术降低肿瘤细胞中BMI-1和RNF2蛋白的表达,在体内确实发挥了放射增敏作用。2体内BMI-1 sh RNA和RNF2 sh RNA转染食管鳞癌细胞的沉默效果Western blotting结果显示,沉默BMI-1或RNF2基因组裸鼠移植瘤中BMI-1和RNF2蛋白表达水平明显降低(P0.01),体内实验沉默BMI-1、RNF2蛋白表达的效果明显,沉默效率分别为66.67%和68.21%。3沉默BMI-1或RNF2对裸鼠移植瘤组织凋亡的影响TUNEL法检测剥离肿瘤组织发现,照射后各组移植瘤的凋亡水平均明显高于其照射前凋亡水平,差异具有统计学意义(P0.05)。此外,照射前BMI-1 sh RNA或RNF2 sh RNA组移植瘤的凋亡水平均显著高于control与NC组,差异具有统计学意义(P0.05),照射后这种趋势更明显。表明BMI-1或RNF2敲低联合放射线照射能诱导移植瘤组织的凋亡,从而促进了肿瘤细胞对放射线的敏感性。4肿瘤组织标本中BMI-1和RNF2蛋白的表达免疫组织化学研究结果发现BMI-1和RNF2蛋白主要在细胞核表达,而较少在细胞浆表达。与照射前相比,照射后各组肿瘤组织中BMI-1和RNF2蛋白的表达水平稍高,但差异均未见统计学意义(P0.05);此外,照射前BMI-1 sh RNA或RNF2 sh RNA组细胞中BMI-1和RNF2蛋白的表达水平均明显低于control与NC组(P0.05),照射后这种趋势更明显。5肿瘤组织标本中凋亡相关蛋白的表达免疫组织化学检测结果显示,照射后各组bcl-2蛋白的表达水平均显著低于相应的未照射组,差异具有统计学意义(P0.05)。与control、NC组相比,照射前BMI-1 sh RNA和RNF2 sh RNA组bcl-2蛋白的表达水平均明显下降(P0.05);与control或NC联合照射组相比,BMI-1 sh RNA或RNF2 sh RNA联合照射组bcl-2蛋白的表达水平均明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。照射后各组bax蛋白的表达水平均显著高于相应的未照射组,差异具有统计学意义(P0.05)。与control、NC组相比,照射前BMI-1 sh RNA和RNF2 sh RNA组bax蛋白的表达水平均明显升高(P0.05);与control或NC联合照射组相比,BMI-1 sh RNA或RNF2 sh RNA联合照射组bax蛋白的表达水平均显著增加,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:沉默BMI-1和RNF2基因在体内可能通过下调bcl-2蛋白表达,上调bax蛋白表达,诱导了裸鼠移植瘤组织的凋亡,抑制了裸鼠移植瘤的生长,在体内提高了食管鳞癌细胞的放射增敏作用。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.1

【参考文献】