LPS调控静脉内皮细胞膜形态及通透性引发血栓形成的实验研究

发布时间：2016-11-19 16:30

  本文关键词：LPS调控静脉内皮细胞膜形态及通透性引发血栓形成的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

《昆明医科大学》 2015年

LPS调控静脉内皮细胞膜形态及通透性引发血栓形成的实验研究

白云城  

【摘要】：[背景与目的]：深静脉血栓是心血管系统的常发疾病,也是骨科住院患者常见的并发症之一。在血栓形成的三要素中,血管壁改变是血栓形成的关键要素。静脉血管壁包括内膜、中膜和外膜,其中,直接与血液接触的内膜由静脉内皮细胞层包绕形成,它可以稳定血管通透性,维持正常的内皮屏障功能,当内皮屏障功能受到损害时,储存于内皮下层的组织因子(Tissue factor,TF)异常释放入血,启动外源性凝血途径,促血栓形成。因此阐明深静脉血栓形成时静脉内皮细胞通透性改变及调控机制有非常重要的实用意义。研究表明细胞骨架结构及紧密连接(tight junction, TJ)是内皮屏障结构和功能的主要基础。LPS作为细菌内毒素可以引起机体严重的脓毒血症,LPS在体内微循环发生促使纤维蛋白异常增多的生物学炎性作用,进而导致弥散内血管凝血(DIC), DIC的本质就是微小毛细血管被嗜酸性同质性纤维蛋白堵塞,形成“透明血栓”。LPS更主要的生物学功能作用体现在对细胞膜稳定性和完整性的影响。有研究发现LPS导致的血管内膜炎症反应会破坏内皮细胞膜的完整性,在血小板减少小鼠模型中比正常小鼠出现更多的出血反应,炎症反应引起的血管内膜稳定性和完整性损害是血小板减少症出血的核心诱因,LPS介导的炎症反应主要依靠血小板ITAM通路而不是经典的GPCR通路来调控血管内膜的稳定性。DVT也是与血管内膜稳定性关系密切的疾病,根据前述研究,我们推断LPS引起的静脉内膜改变可能参与DVT病理生理过程。静息状态下,静脉内皮细胞层是一层排列整齐的功能屏障层,细胞之间的连接秩序井然,有效防止了储存于内皮下层的凝血因子TF释放入血。静脉内皮细胞主要通过两种骨架蛋白--肌球蛋白和肌动蛋白来维持相互之间的张力及细胞膜形态,炎症反应发生之后,炎症反应导致的静脉内皮细胞分泌粘附分子如E-selectin、ICAM-1发生功能改变,内皮细胞肌球蛋白和肌动蛋白构象发生变化与重排内皮细胞膜表面发生“皱褶”,出现细胞物理间隙,进而引起内皮屏障功能损害。血管内皮屏障功能得以维持还依靠于一个重要结构基础即细胞间连接,血管内外的小分子物质通过胞旁途径转运时,主要通过细胞紧密连接的方式进行调节,紧密连接的物理结构由数种跨膜蛋白和细胞内胞质蛋白组成,其中最具决定性生物学作用的是细胞间紧密连接蛋白ZO-1。LPS刺激所导致的血管炎症反应如何改变细胞间连接蛋白的表达,从而影响内皮细胞通透性?考虑到炎症反应-深静脉血栓形成关系研究中存在一些不确定因素,以及进一步探索LPS引发静脉内皮细胞膜形态与通透性改变在深静脉血栓形成所起的作用,本研究重点探讨LPS刺激细胞粘附分子分泌、炎性粘附增加、细胞形态及内皮通透性的改变、促进血栓形成的分子机制。[方法]：(1)建立大鼠下腔静脉血栓模型,观察下腔静脉静脉狭窄后2小时-21天的下腔静脉血栓形成情况,取材称量比较各个时间点血栓的质量及长度并进行病理检测,得出大鼠下腔静脉血栓发生、发展、消退的时间规律；采集血浆标本检测细胞因子IL-6、CRP、TLR、TNF-α的蛋白表达变化；静脉壁qPCR检测E-selectin及细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的mRNA表达变化情况。采用线性相关分析(Linear regression analysis, Pearson)方法,对上述细胞因子与深静脉血栓长度、质量的线性关系进行拟合分析。(2)LPS腹腔注射加下腔静脉狭窄法制造内毒素炎症下腔静脉血栓模型,另设对照组,造模后24h取材称量下腔静脉壁+血栓质量、长度,用10%中性甲醛液将整段血栓+静脉壁固定(en bloc技术),脱水石蜡包埋,运用静脉壁形态定量测定(Vein Wall Morphometrics)分析技术,根据高倍镜下不同细胞形态,统计中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、总炎性细胞数目；用Masson、vG特殊染色方法,半定量观察静脉壁与血栓的纤维蛋白含量变化。免疫组化SP法测定E-selectin、P-selectin、ICAM-1表达变化,并测定TF含量。(3)设定不同的LPS终浓度(10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、 400ng/ml)和不同的LPS刺激时间(3h、6h、12h、24h、48h), qPCR法半定量检测不同刺激条件下的E-selectin、ICAM-1mRNA转录水平。选定LPS的刺激条件：200ng/ml,24h,设立空白对照组和LPS刺激组,分别用免疫组化荧光染色来检测E-selectin、ICAM-1表达变化；采用Transwell,分别检测THP-1细胞与HUVECs的粘附情况和迁移情况,了解LPS对内皮细胞和炎性细胞的粘附、迁移能力影响。(4)将HUVECs接种于96孔细胞培养板,37。C、5%C02培养箱孵育培养24h。更换不含青-链双抗的新鲜培养基,加入Y-27632 (Sigma-Aldrich),其终浓度为10UM,37。C、5%C02培养箱孵育培养30min(此步过程为信号通路抑制剂预处理)。更换不含青-链双抗的新鲜培养基,加入LPS (Sigma-Aldrich),终浓度200ng/mL,另设一组不加LPS作为空白对照。两种处理因素结合共孵育24h。免疫荧光法检测各组F-actin的变化；蛋白印迹法检测各组紧密连接蛋白-I表达情况。[结果]：(1)狭窄法造模后至各个取材的时间点大鼠存活率均为100%,大鼠下腔静脉血栓稳定形成。细胞因子IL-6、CRP、TLR、TNF-α在造模后有不同程度的升高变化。静脉壁qPCR检测E-selectin及细胞间粘附分子-1 (ICAM-1)的mRNA表达变化发现,在造模后6h, E-selectin及ICAM-1均有显著表达变化,其mRNA表达上升,并维持较高变化水平变化直至21d。(2)LPS在注射后24小时血药浓度达峰值,Masson和vG染色显示肝肺发生严重的纤维化和炎症反应,证实LPS对大鼠机体的炎症影响。LPS注射后IVC血栓的质量和血栓的质量长度比都发生了显著升高(P0.05)。静脉壁(血栓)切片染色结果证实注射LPS后血栓密度增加,Masson和vG染色结果发现LPS促使血栓中纤维蛋白含量增加。静脉壁形态测定发现注射LPS后炎性细胞总数增加,其中,单核细胞增加最显著(P0.05)。免疫组化SP法测定发现在LPS刺激后,E-selectin粘附分子的表达含量增加(P0.05),P-selectin表达变化不明显,TF的含量增加(P0.05),TF的增加程度与纤维蛋白呈线性相关。(3)LPS刺激HUVECs可以使得E-selectin及ICAM-1的mRNA转录水平增加,差异具有统计学意义,表达水平的改变与LPS刺激时间和刺激浓度均呈依赖关系。免疫荧光检测结果发现,在静息状态下HUVECs不表达E-selectin和ICAM-1,而在LPS刺激状态下,E-selectin和ICAM-1在HUVECs胞浆内均有强表达,说明LPS增加了HUVECs胞浆内E-selectin、ICAM-1的蛋白表达水平。在LPS刺激情况下,HUVECs与THP-1的粘附率较LPS空缺情况下要高(53.2±4.8%vs.17.1±6.5%,P0.05); LPS刺激后,THP-1细胞的迁移率为50.2±6.3%,高于空白对照组(17.8±4.6%)。(4)激光共聚焦显微镜下显示,空白对照组HUVECs内的F-actin分布于细胞膜周边,呈均匀分布；LPS刺激组F-actin细胞膜周边的分布明显减少,而细胞胞浆中出现应力纤维增多；Y-27632预处理组细胞内应力纤维较LPS刺激组少,但较空白对照组仍有一定程度增加。显示LPS刺激影响HUVECs细胞骨架改变与重排。一组用小分子Y-27632加入HUVECs预处理30分钟,再加入LPS,另一组单加LPS,刺激24h后用蛋白印迹法检测细胞间紧密连接蛋白ZO-1发现：Y-27632预处理使得对照LPS刺激HUVECs后细胞间紧密连接蛋白-1变化不显著,说明RhoA/ROCK信号通路参与调节LPS介导的细胞通透性改变。[结论]：1.下腔静脉狭窄法(stenosis)可成功建立动物血栓模型,下腔静脉狭窄法建模成功基于大鼠(啮齿类动物)独特的脉管系统。2.动物模型血栓病变分期可分为起始期、稳定期和消退期,在三个病变分期中均有炎症因素参与。3.LPS促进了动物模型成栓效应。LPS增强粘附分子与TF在DVT表达,此效应与内皮屏障受损有关。4.LPS在一定的刺激浓度和刺激时间作用下刺激导致HUVECs功能活化,RhoA/ROCK信号通路被抑制影响了F-actin的表达分布,抑制RhoA/ROCK信号通路可以使得LPS对HUVECs细胞骨架重排的刺激作用发生逆转。5.LPS改变内皮细胞膜形态及通透性的分子机制：LPS通过激活RhoA/ROCK信号通路,下调细胞间紧密连接蛋白ZO-1和细胞F-actin蛋白表达,细胞膜微丝增多,增加细胞通透性。

【关键词】：
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.6
【目录】：

下载全文 更多同类文献

CAJ全文下载

(如何获取全文？ 欢迎：购买知网充值卡、在线充值、在线咨询)

CAJViewer阅读器支持CAJ、PDF文件格式

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 刘海平;赵学凌;吴雪梅;李兴国;郑宏宇;;巨噬细胞炎性蛋白1α在小鼠深静脉血栓模型中的表达及其意义[J];重庆医学;2013年04期

2 杨立森,林媛豪,石学宁,梅运丽,李玉梅,武玲,潘月英,陈树兰;可溶性E-选择素对冠心病心绞痛的诊断意义[J];临床心血管病杂志;2003年05期

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 宋庆桥;胡元会;王诗涵;周育平;储瑜光;曹雪滨;李俊峡;潘菊华;;冠心病稳定型心绞痛患者基质金属蛋白酶-9、可溶性E选择素及组织型纤溶酶原激活物抑制剂-1表达变化[J];临床心血管病杂志;2011年02期

2 白云城;赵学凌;周如丹;周志化;吴雪梅;王兵;;大鼠下腔静脉血栓模型的建立及手术技巧[J];南京医科大学学报(自然科学版);2014年03期

3 洪永敦;朱会英;陈宇鹏;吴辉;莫鸿辉;黄衍寿;史成军;;冠心病痰瘀证候与E选择素G98T及S128R基因多态性的关系研究[J];广州中医药大学学报;2009年01期

4 王丽萍;张蕴莉;;细胞黏附分子选择素家族中E-选择素及其基因多态性[J];中国组织工程研究与临床康复;2009年41期

5 冯国飞;谢志泉;;心血管生化标志物在早期诊断冠心病的研究进展[J];心血管病学进展;2011年01期

6 高敏;;E-选择素与心血管疾病[J];医学综述;2006年01期

7 杨胜茹;;E-选择素研究进展[J];医学综述;2008年09期

8 张蕴莉;王丽萍;唐甜甜;;中国北方汉族人群E-选择素第2外显子+G98T基因多态性与冠心病关系的研究[J];中国现代医学杂志;2011年28期

9 白云城;赵学凌;周如丹;周志化;吴雪梅;;动物模型血栓长度及重量比较探索深静脉血栓形成病变分期[J];中国修复重建外科杂志;2014年04期

10 卜鹏飞;周如丹;赵学凌;;狭窄法动物深静脉血栓模型方法学及其应用研究进展[J];中国民康医学;2015年13期

中国博士学位论文全文数据库 前3条

1 王艾丽;蒙古族人群炎症和内皮功能标志与心脑血管病的关系[D];苏州大学;2010年

2 徐冰;粘附分子与UAP中医证候相关规律及黄芪多糖干预机理研究[D];北京中医药大学;2012年

3 莫鸿辉;IL-6、ICAM-1、ApoE血清水平及基因多态性与冠心病证侯关系研究[D];广州中医药大学;2007年

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 周志化;Plat、Plau激活内皮细胞膜上纤溶酶促血栓消退的研究[D];昆明医科大学;2014年

【二级参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 邓姝;;预防关节置换术后深静脉血栓的管理措施[J];重庆医学;2011年10期

2 张利;张永川;赵渝;;深静脉血栓形成后综合征研究进展[J];重庆医学;2011年11期

3 莫建文;黄河;张春强;王兵;何飞;殷亮;徐军;陈昊;赵学凌;李世和;;创伤性深静脉血栓形成中补体相关基因表达变化的实验研究[J];中国急救医学;2008年03期

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 卫朝霞,刘永波;一种新的内皮细胞分离方法[J];河南职工医学院学报;2003年03期

2 任德成;胡娟娟;张均田;杜冠华;;血管内皮细胞损伤机制研究[J];医学研究通讯;2003年10期

3 潘虹;王庭槐;;内皮细胞caveolae,caveolin-1的生理功能[J];医学综述;2006年22期

4 殷观梅;;血管内皮细胞生长抑制因子研究进展[J];河北医药;2008年12期

5 刘宝宜,陈铁镇,张宝庚,宋继业;动脉粥样硬化形成过程中内皮细胞病变的研究(摘要)——主动脉内皮细胞平鋪,扫描电镜及透射电镜的观察[J];中国医科大学学报;1981年S1期

6 刘宝宜,陈铁镇,张宝庚,宋继业;动脉粥样硬化形成过程中内皮细胞的形态学变化的研究(主动脉内皮细胞平铺技术,扫描电镜及透射电镜的方法)[J];中国医科大学学报;1982年03期

7 张连元;;动脉粥样硬化发病机理中平滑肌和内皮细胞的机能[J];煤矿医学;1983年04期

8 刘怀琼;李德馨;;内皮细胞的功能与休克的关系[J];国外医学.麻醉学与复苏分册;1985年04期

9 何泽涌;;关于内皮细胞研究的某些进展[J];山西医药杂志;1987年03期

10 何泽涌;;关于内皮细胞研究的某些进展[J];山西医药杂志;1987年04期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 应大君;陈卫军;周丁华;;内皮细胞机械感受功能的实验研究[A];面向21世纪的科技进步与社会经济发展（下册）[C];1999年

2 邓红;李懿萍;来茂德;;高糖环境细胞间相互作用对内皮细胞产生活性氧和血管内皮细胞生长因子的影响[A];中华医学会病理学分会2005年学术年会论文汇编[C];2005年

3 林萍章;PualJ.Pearson;RaymondCartier;KazuhiroHashimoto;HartzellV.Schaff;;内膜再生过程中,内皮细胞之反应[A];海峡两岸电子显微学讨论会论文专集[C];1991年

4 赵彭涛;李志超;董明清;贾斌;张莉莉;;LPS对培养的BPAECsⅠ型Na~+/H~+交换器活性的影响[A];第六次全国缺氧和呼吸病理生理学术会议论文摘要汇编[C];2003年

5 熊建琼;朱佩芳;王正国;蒋建新;;髓样分化蛋白-2在内毒素与内皮细胞结合中的作用[A];第十一次全国急诊医学学术会议暨中华医学会急诊医学分会成立二十周年庆典论文汇编[C];2006年

6 王心华;甄永苏;;烯二炔类抗生素力达霉素抑制内皮细胞生长和诱导内皮细胞凋亡[A];2000全国肿瘤学术大会论文集[C];2000年

7 李彦荣;应晨江;易海维;衣卫杰;孟依;刘烈刚;孙秀发;;绿茶多酚对牛内皮细胞窖蛋白-1表达的影响[A];湖北省、武汉市营养学会第十一届学术会议论文汇编[C];2007年

8 蔡绍皙;张莉;韩亚刚;蒋稼欢;;流动腔底面内皮细胞图型化研究与图像处理[A];第十次中国生物物理学术大会论文摘要集[C];2006年

9 汪毅;陈允钦;;高密度脂蛋白与内皮功能[A];第六次全国中西医结合心血管会学术会议论文汇编[C];2002年

10 马向红;黄体钢;杨万松;周丽娟;;四氢生物喋呤对内皮细胞产生一氧化氮和超氧阴离子的影响[A];中华医学会心血管病分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2004年

中国重要报纸全文数据库 前6条

1 ;[N];科技日报;2000年

2 赵军;[N];科技日报;2007年

3 华朋;[N];中国老年报;2000年

4 高国起;[N];中国医药报;2010年

5 佳愉;[N];中国中医药报;2009年

6 刘道安;[N];中国医药报;2005年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 白云城;LPS调控静脉内皮细胞膜形态及通透性引发血栓形成的实验研究[D];昆明医科大学;2015年

2 宋恩;内皮细胞源性KLF15调控TM激活蛋白C抗凝血途径及MCP-1介导炎性反应影响DVT形成的实验研究[D];昆明医科大学;2015年

3 宋凯;口腔癌—内皮细胞融合的分子调控机制及潜在作用[D];武汉大学;2014年

4 张可满;氧化型LDL对血管内皮细胞的诱导激活[D];中国协和医科大学;2000年

5 贾素洁;内源性一氧化氮合酶抑制物与内皮细胞通讯功能障碍及（口山）酮的保护作用[D];中南大学;2007年

6 郭志坚;晚期糖基化终产物修饰的蛋白质对人血管内皮细胞的病理生物学作用及其机制的研究[D];第一军医大学;2002年

7 肖晖;内皮细胞硫酸乙酰肝素蛋白聚糖与细胞粘附关系的实验研究[D];山西医科大学;2005年

8 李毅;活化蛋白C对脂多糖诱导内皮细胞活化的影响[D];中国协和医科大学;2002年

9 陈丽华;一种新的内皮细胞可诱导性粘附分子的表达调变及功能研究[D];第四军医大学;2000年

10 郑敏哲;初探内皮细胞膜微粒（EMPs）于体外对内皮细胞功能及凋亡的影响[D];中国协和医科大学;2008年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 王冰;Y盒结合蛋白-1C末端结构域调节血管新生的机制研究[D];河北大学;2015年

2 米雪楠;MicroRNAs对血管内皮细胞衰老及血管功能影响的研究[D];北京协和医学院;2015年

3 王媛;Ti表面四种生物分子功能修饰层的对比研究[D];西南交通大学;2015年

4 潘芝娟;抗HLA抗体对异基因造干细胞移植预后的影响及其机制研究[D];苏州大学;2015年

5 邵洁;TNFAIP8L1在动脉粥样硬化中的作用研究[D];山东大学;2015年

6 高雪;环境因子对内皮细胞影响及相关磷脂图谱的建立[D];天津大学;2007年

7 陈瑶;IGF-1对受损血管内皮细胞的影响及机制研究[D];重庆医科大学;2011年

8 李强;晚期糖基化终产物诱导内皮细胞紧密连接形态学改变机制的研究[D];第一军医大学;2006年

9 贾红丹;血小板微颗粒影响内皮细胞血管内皮生长因子表达及机制[D];天津医科大学;2010年

10 张瑜;尿酸在氧化应激状态下致肾小球内皮细胞损伤的机制探讨[D];昆明医科大学;2012年

  本文关键词：LPS调控静脉内皮细胞膜形态及通透性引发血栓形成的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：182786