棘球蚴囊液蛋白质组学及主要分泌蛋白对宿主免疫调节的影响

发布时间：2018-05-02 23:43

  本文选题：棘球蚴 + 蛋白质组　； 参考：《新疆医科大学》2015年博士论文

【摘要】：目的:棘球蚴病,又称为包虫病,是由棘球绦虫幼虫寄生于人体及绵羊等中间宿主体内所致的一种严重的人畜共患寄生虫病,呈世界性分布。在我国人体包虫病主要有两种类型,即由细粒棘球绦虫(Eg)引起的囊型包虫病(CE)和由多房棘球绦虫(Em)引起的泡型包虫病(AE)。两型包虫病危害严重,防治研究刻不容缓。本研究旨在:(1)建立更加稳定的Eg、Em体外成囊培养系统,为棘球绦虫的生物学和医学生物学研究及抗棘球蚴药物的筛选和疫苗的研制提供实验材料;(2)通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)蛋白质组学分析方法,对体外成囊培养系统获得的囊液进行蛋白质组深度测序,确定离体正常发育包囊囊液中分泌蛋白表达谱,筛选出可能对宿主免疫系统具有调节作用的分泌蛋白;(3)探讨棘球蚴主要的分泌蛋白之一抗氧化蛋白EgTPx对宿主巨噬细胞极化方式的调节及在棘球蚴感染早期中免疫逃避机制的作用。(4)研究Eg感染对过敏性哮喘减轻或抑制的可能作用机制,为利用蠕虫的免疫调控机制开辟新的自身免疫性疾病及及过敏性疾病的防治策略提供重要依据。方法:(1)分别从屠宰场自然感染Eg的绵羊肝脏及实验室Em保种的灰仓鼠病灶中采集新鲜原头蚴(PSC),经1%的胃蛋白酶消化后检测虫体活性并计数,于37℃、5%CO2条件下体外培养,在培养的不同时间点随机取适量样品于倒置显微镜下观察、拍照并记录原头蚴生长发育情况,通过透射电子显微镜观察培养囊泡的超微结构;分别将体外培养获得的Eg和Em微囊以每鼠50个微囊的剂量,通过腹腔注射的方法分别接种BALB/c小鼠,并对接种感染获得的包虫囊进行计数和HE染色,计算感染率和成囊率。(2)分别收集来自体外培养的eg和em囊泡中的囊液,经真空冷冻干燥、定量、酶解和scx分离后,采用基于tripletof5600的lc-esi-msms分析系统和蛋白数据库(eg_proteins.fa和em_proteins.fa以及牛血清库uniprot_bovine_serum.fa)进行囊液中蛋白表达谱的鉴定和生物信息学分析,并使用signaip,tmhmm,targetp软件对鉴定到的蛋白进行分泌蛋白预测分析。(3)通过体外培养psc,利用rnai技术沉默egtpx基因的表达,确定egtpx对细粒棘球蚴正常生长存活的必要性;通过rt-pcr方法克隆egtpx基因,通过点突变的方法构建其突变体,利用大肠杆菌表达系统表达egtpx及其突变体蛋白,通过保护超螺旋dna实验及还原剂dtt实验鉴定其生物学功能;采用贴壁法分离纯化感染eg和em微囊的小鼠腹腔巨噬细胞,使用巨噬细胞的特异性引物(inos、ym1、fizz1、arginase1)pcr扩增鉴定巨噬细胞极化类型;通过m-csf体外诱导培养小鼠骨髓来源的巨噬细胞,分别添加lps、il-4、囊液抗原、重组蛋白egtpx及其突变体蛋白进行刺激,收集细胞提取rna,使用巨噬细胞的特异性引物进行pcr扩增鉴定巨噬细胞极化类型。(4)采用卵清白蛋白(ova)致敏和激发小鼠建立细粒棘球蚴感染并发过敏性哮喘实验动物模型,通过小鼠无创肺功能检测仪检测小鼠气道高反应;he及pas染色观察肺组织病理切片炎症细胞浸润程度;通过rt-qpcr、wb以及流式检测肺组织、血液、脾脏中th1/th2/th17/treg相关细胞因子的表达水平变化,探讨细粒棘球蚴感染是否对过敏性哮喘气道炎症具有减轻或抑制作用,并分析其可能的作用机制。结果:(1)eg和em原头蚴在体外培养15天时微囊逐渐形成,60天时包囊具有透明角质层结构,100天后形成肉眼可见的较大囊泡,超微结构显示eg囊泡外部有较厚的无细胞薄片层,而em囊泡薄片层较薄,生发层细胞较为丰富,并可见生发囊及囊内原头蚴产生。微囊接种小鼠感染率均为100%,eg包虫囊为游离单囊,成囊率达70%,囊内无psc产生。em包虫囊为似肿瘤状的团块状结构,有生发囊及原头蚴产生。(2)sds-page显示eg和em囊液蛋白主要集中在1-100kda之间,采用lc-ms/ms分别鉴定得到774个eg蛋白,2305个em蛋白和39个牛血清相关蛋白。其中,eg经典型分泌蛋白有52个,em有122个,主要包括抗原b的不同亚型。经go功能注释发现eg和em囊液蛋白所参与的生物过程主要为:细胞加工处理(cellularprocess),代谢过程(metabolicprocess),生物调节(biologicalregulation)和应激反应(responsetostimulus)等;所参与的分子功能主要为:结合(binding)和催化活性(catalyticactivity)等;在细胞组分中,绝大多数的蛋白质都归为细胞(cell),细胞部分(cellpart),细胞器(organelle),高分子复合物(macromolecularcomplex)等。(3)通过观察psc的活性状态,确定体外自然状态下psc耐受h2o2的最大浓度为0.6mm,1h;利用rnai技术沉默egtpx基因表达,筛选出有效干扰序列为tpxsirna-3;成功克隆egtpx基因并构建其3个突变体,在大肠杆菌表达系统获得表达,mco系统和还原剂DTT鉴定重组EgTPx具有抗氧化的生物学特性;棘球蚴感染、重组EgTPx及其突变体蛋白均可替代性激活巨噬细胞为M2型。(4)Eg感染可抑制OVA诱导的小鼠气道高反应;HE和PAS染色显示Eg感染可减少OVA诱导的小鼠肺支气管周围的炎性细胞浸润及粘液分泌;RT-qPCR和流式检测显示Eg感染后Treg细胞及IL-10水平升高,Th17细胞及IL-17A水平降低,推测Eg感染可能是通过上调了IL-10的表达,下调了IL-17A的表达,导致了Treg/Th17的失衡从而抑制哮喘的气道炎症反应。结论:(1)成功建立稳定的细粒棘球蚴和多房棘球蚴体外成囊培养模型,可完全剔除宿主因素的干扰,研究特定因素对虫体生长与发育的作用,为后续囊液蛋白质组学研究提供充足的实验材料。(2)成功建立微囊法接种小鼠细粒棘球蚴和多房棘球蚴继发感染动物模型,有利于进行疫苗的研制,药物筛选和疗效的判定,为预防和控制棘球蚴病起重要指导作用和奠定坚实基础。(3)首次对体外培养获得的棘球蚴囊液进行了较为全面、系统的蛋白质组学研究,鉴定到一些高表达的分泌蛋白,它们与宿主之间的相互作用、自身的能量代谢、抗氧化损伤密切相关,对于维持虫体正常的生命活动具有重要意义。深入研究这些蛋白质的功能,将为阐明某些棘球绦虫免疫逃避的分子机制提供重要理论依据。(4)利用RNAi技术通过电转途径可有效沉默细粒棘球蚴EgTPx基因的表达,明确EgTPx对细粒棘球蚴抵抗氧化损伤,维持正常生长存活十分必要,研究结果将为棘球绦虫及其他寄生虫基因功能的研究提供技术参考资料。(5)成功构建并表达EgTPx基因及其3个突变体,明确棘球蚴感染和抗氧化蛋白EgTPx可诱导巨噬细胞向M2型极化,从而释放抗炎因子,对于抑制Th1型炎症反应和促进Th2型免疫应答,维持在宿主体内的寄生至关重要。(6)利用细粒棘球蚴感染并发过敏性哮喘实验动物模型,发现Eg感染对过敏性哮喘气道炎症具有减轻或抑制作用。Eg感染引起Treg相关细胞因子IL-10的水平升高,Th17相关细胞因子IL-17A的水平降低,通过IL-10可抑制Th17细胞的分化导致Treg/Th17的失衡,推测包虫感染对宿主产生的这种Treg/Th17失衡的免疫调控可能是减轻或抑制过敏性哮喘气道炎症作用机制,为利用蠕虫及其主要分泌蛋白的免疫调控机制开辟新的自身免疫性疾病及及过敏性疾病的防治策略提供重要依据。
[Abstract]:Objective : To study the possible mechanism of immune regulation of Echinococcus granulosus in vitro . ( 2 ) To study the possible mechanism of immune regulation of Echinococcus granulosus in vitro and to identify the possible mechanism of immune evasion in the early stage of Echinococcus granulosus infection . ( 3 ) In vitro culture of psc , the expression of egtpx gene was silenced by using rnai technique . The expression of egtpx and its mutant proteins were determined by reverse transcription polymerase chain reaction ( RT - PCR ) . (2)sds-page鏄剧ずeg鍜宔m鍥婃恫铔嬬櫧涓昏�侀泦涓�鍦，

本文编号：1835986