天然产物Britanin的靶标发现及神经保护作用研究
发布时间：2018-05-04 14:51
本文选题：Britanin + 靶标发现 ； 参考：《第二军医大学》2017年博士论文
【摘要】：1、研究目的人体活性氧水平的不断增加,会打破氧化还原平衡状态,引起氧化应激反应。氧化应激在神经退行性疾病、组织器官损伤和自身免疫病等一系列疾病的发生发展中发挥重要的作用。在脑缺血再灌注过程中,脑组织内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平会大量升高,进而引起脑组织损伤。因此,通过提高机体抗氧化水平降低机体氧化应激压力,成为脑卒中治疗的一条重要途径。Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2)信号通路是机体抵抗氧化压力的最重要途径之一。通过激活Nrf2信号通路,可以增强机体抵抗氧化损伤的能力。因此,激活Nrf2信号通路成为针对多种退行性疾病和慢性疾病的治疗途径。靶向Nrf2信号通路是开发针对神经退行性疾病和慢性疾病治疗药物的新研究方向。天然产物来源丰富,药理药效开发潜能具大。回顾整个药物研究的历史,天然产物一直在其中发挥着举足轻重的作用,贡献了诸多疗效明确、不可或缺的药物。天然产物Britanin是一个倍半萜内酯类化合物,广泛分布于菊科旋覆花属植物中。本课题通过构建体外神经细胞损伤模型,研究Britanin的神经保护作用。为了阐明Britanin发挥神经保护作用的机制,我们开展了Britanin对氧化应激和Nrf2信号通路的调控作用的研究。期望能够发现Britanin调控Nrf2通路的分子靶标。最终,通过构建实验性大鼠脑缺血再灌注损伤(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,评价Britanin在体内水平发挥神经保护作用的能力。综合上述系列研究,为把Britanin开发成新颖的氧化应激相关疾病治疗药物奠定临床前研究基础。2、研究方法(1)体外神经细胞损伤模型的构建。参考目前神经保护方面的研究进展,构建了两种体外神经细胞损伤模型。分别是高浓度谷氨酸诱导PC12细胞损伤模型;氧和葡糖糖剥夺再补充(oxygen glucose deprivation followed by reperfusion,OGD-R)诱导原代皮层神经元损伤模型。在这两种细胞模型基础上,研究天然产物Britanin的神经保护作用。(2)研究Britanin对Nrf2信号通路的调控作用。天然产物Britanin可以保护神经细胞,降低氧化应激引起的细胞损伤。本研究在原代神经元细胞水平上,采用ARE(antioxidant response element)报告基因实验、siRNA干扰实验、实时荧光定量PCR(Polymerase Chain Reaction)检测实验和蛋白免疫印迹实验等方法,探究Britanin对Nrf2抗氧化信号通路的调控作用。(3)验证Britanin与靶标蛋白Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1)的共价结合作用。Keap1蛋白是Nrf2蛋白的负性调控蛋白,通过结合Nrf2蛋白引起其泛素化修饰和程序性降解。本研究采用大肠杆菌原核表达系统,表达并纯化人源Keap1全长蛋白及其BTB结构域。本课题组前期研究中,设计合成了生物素化修饰的Britanin小分子探针。在体外机制研究实验中,本研究采用小分子探针Pull-down靶标蛋白Keap1的方法,初步确证二者之间的相互作用。为了进一步确证Britanin与靶标蛋白Keap1之间的结合位点,本研究采用LC-MS(liquid chromatograph-mass spectrometer)分析方法,研究Britanin对Keap1蛋白序列中半胱氨酸的修饰作用,确定共价结合位点。为了明确Britanin与Keap1蛋白BTB结构域的结合模式,本研究开展了Britanin与靶标蛋白Keap1的复合物共结晶实验。为了阐明Britanin激活Nrf2信号通路的分子机制,我们研究了Britanin对Nrf2蛋白泛素化水平的调控作用及调控机制。(4)体内构建大鼠MCAO模型。与体外研究采用的OGD-R诱导原代皮层神经元损伤模型相对应,我们构建了大鼠体内MCAO模型,考察Britanin在动物体内发挥抗氧化和神经保护作用的能力。3、研究结果通过体外神经细胞保护实验,我们发现Britanin可以显著的保护神经细胞,降低氧化应激诱导的细胞损伤。在这一过程中Britanin可以显著下调神经细胞受到损伤刺激时的ROS水平。Nrf2信号通路是机体抵抗氧化压力,维持氧化还原稳态的最重要调节通路。通过报告基因实验和基因干扰实验,我们发现Britanin可以显著激活Nrf2信号通路,提高Nrf2信号通路下游抗氧化酶的表达水平,进而发挥神经保护作用。Keap1蛋白是Nrf2信号通路的负性调节蛋白,可能是Britanin的作用靶标。应用小分子探针Pull-down实验,我们确证了Britanin与靶标蛋白Keap1之间的相互作用。通过LC-MS联用实验,进一步找到了Britanin与Keap1之间的共价结合位点。通过复合物共结晶实验,我们得到了Britanin与Keap1蛋白BTB结构域的共结晶结构,确证Britanin通过迈克尔加成反应共价结合于Keap1的151位半胱氨酸的结合模式。通过进一步的分子机制研究,我们发现Britanin通过靶向Keap1蛋白,干扰了Keap1与Cul3之间的相互作用,使Cul3不能进一步介导对Nrf2蛋白的泛素化修饰和蛋白酶体降解,进而激活Nrf2信号通路。应用大鼠急性脑缺血再灌注损伤模型,我们考察了Britanin在体内提高机体抵抗氧化应激,发挥神经保护作用的能力。Britanin灌胃给药可以激活Nrf2通路,显著降低脑组织梗死体积,改善行为学评分。4、研究结论本课题发现天然产物Britanin通过靶向Keap1蛋白,激活Nrf2信号通路。Britanin是一个全新的Nrf2信号通路激动剂。通过共结晶结构解析,揭示了Britanin与Keap1蛋白的结合模式,阐明了Britanin激活Nrf2信号通路的分子机制。通过体外神经细胞保护模型和体内大鼠脑缺血再灌注损伤模型,我们发现Britanin通过激活Nrf2信号通路,可以显著提高机体抗氧化水平,进而发挥神经保护作用。在后续研究中,通过对Britanin进行结构改造和筛选Britanin的结构类似物,有希望发现活性更优、选择性更好的先导化合物,开发成为氧化应激相关疾病的全新治疗药物。
[Abstract]:1,鐮旂┒鐩殑浜轰綋娲绘，
本文编号：1843387
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/yxlbs/1843387.html
教材专著
