三氯乙烯致肝细胞毒性中SET介导的nucleolin自调控机制研究

  本文关键词：三氯乙烯致肝细胞毒性中SET介导的nucleolin自调控机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景与目的三氯乙烯(trichloroethylene, TCE)曾是一种被广泛使用的工业溶剂,被用作金属清洗、火箭引擎清洁、干洗以及植物油萃取、甚至麻醉剂的主要成分等。同时三氯乙烯也被作为原料来制造各种塑料制品,包括输送管线、电线、电缆涂层及包装材料等。三氯乙烯已成为广东省和深圳市的重点职业毒物,曾给广东省和深圳市带来严重的职业危害和重大的经济损失。三氯乙烯同时也是一种环境化学污染物,它主要通过呼吸道吸入和皮肤吸收进入机体产生危害。体内外实验证明三氯乙烯及其代谢产物可引起遗传毒性、致癌、致突变等作用。2011年,美国环保署(EPA)将三氯乙烯正式定性为人类致癌物。不到一年时间,国际癌症研究中心(IARC)同样也将三氯乙烯从Ⅱ类可能致癌物提升为Ⅰ类人类致癌物。尽管随着用途的变化及替代化合物的广泛使用,人们对三氯乙烯在工业生产中职业暴露的机会越来越少,然而其对地下水源的污染却正在成为一个非常重要的环境问题,因此在日常生活中,三氯乙烯暴露的风险其实并未减少。肝脏是三氯乙烯在体内的重要代谢场所和和主要受损器官之一,三氯乙烯在肝脏中主要代谢途径为：细胞色素P450 (cytochrome P450, CYP450)将三氯乙烯氧化为三氯乙烯环氧化物(trichloroethylene epoxide)中间体,以及毒性较低的三氯乙醛(chlorinated aldehyde)、三氯乙醇(trichloroethanol)和三氯乙酸(trichloroacetic acid),然后这些代谢物经由尿液排出体外。另一条途径是三氯乙烯在谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)的作用下与谷胱甘肽(glutathione, GSH)结合,形成S-(1,2-二氯乙烯)谷胱甘肽(DCVG),然后被进一步代谢为S-(1,2-二氯乙烯)-L-半胱氨酸(DCVC)后在肝脏中被逐步分解。三氯乙烯肝脏损害的分子机制仍不太清楚,也缺乏全面系统的研究。在前期工作中,课题组已利用人正常肝细胞(HL-7702,简称L-02)研究三氯乙烯的肝细胞毒性机制,利用蛋白质组学技术筛选了三氯乙烯诱导L-02细胞中的差异蛋白,发现SET蛋白在L-02细胞中与三氯乙烯染毒剂量呈剂量-效应关系。通过构建SET-siRNA稳定干扰的L-02细胞发现,SET蛋白介导了三氯乙烯诱导的L-02细胞毒性。SET蛋白是生命进程中的一个重要因子,它参与了众多关键的生物过程,包括细胞凋亡、核小体组装、染色质重构等,同时它还是真核细胞中重要的组蛋白分子伴侣,它不仅仅参与染色质重构,还是组蛋白乙酰基转移酶抑制因子的重要组成部分,并参与组蛋白乙酰化修饰的抑制过程。SET蛋白也是一个与肿瘤密切相关的蛋白,有多种研究表明SET蛋白参与肿瘤细胞的增殖及肿瘤形成。SET蛋白也是细胞中重要的内源性去磷酸化修饰酶——磷酸酯酶2A(Phosphotase 2A,PP2A)特异性的抑制因子,尽管SET蛋白特异性地抑制PP2A的活性,它却可以在二价锰离子存在的条件下激活磷酸酯酶1。由此可见,SET蛋白在细胞中最重要的生物学过程,磷酸化修饰中扮演着关键角色,并且起到相当重要的作用。蛋白质的磷酸化修饰在真核细胞的生命进程中分子调控与信号转导过程中起到了最基本也是最重要的作用。蛋白质的磷酸化修饰是通过蛋白激酶将三磷酸腺苷(ATP)上的磷酸基团转移到目标蛋白的特定氨基酸残基上。蛋白质的某种活性就能够通过这样的反应将一个或多个特点位点的磷酸化修饰被激活或抑制,从而介导转录、代谢、细胞周期、分化、凋亡、信号转导、细胞免疫等过程。尽管SET蛋白在蛋白磷酸化修饰中具有重要地位,它参与磷酸化修饰的分子机制及生物学意义仍然未被完全阐明。本研究在前期基础上进一步探讨SET蛋白介导的三氯乙烯致肝细胞毒性中蛋白磷酸化变化及其生物学意义。利用磷酸化蛋白质组学技术筛选在L-02细胞中与三氯乙烯毒性相关以及SET介导的磷酸化蛋白,然后进一步探讨了SET蛋白参与nucleolin的整体磷酸化修饰及其自调控机制。实验方法一、三氯乙烯诱导的L-02肝细胞毒性中磷酸化蛋白质组学研究1.细胞培养与染毒处理L-02细胞与SET-siRNA稳定干扰的L-02细胞在37℃,5%CO2条件下,分别用含12%FBS,1%双抗的RPMI 1640培养基贴壁培养于75 cm2细胞瓶中,待细胞融合度达到70%以上时,分别对L-02细胞与SET-siRNA稳定干扰的L-02细胞进行三氯乙烯染毒处理24h,染毒浓度为1/2IC50值(16 mmol/L),即8 mmol/L。2.蛋白提取及蛋白酶解染毒处理后消化细胞,用PBS洗涤三次,用PhosphoSafe磷酸化蛋白裂解液重悬并裂解细胞,高速离心后取含蛋白粗提物的上清液。用Thermo BCA Quantification kit对样品总蛋白进行定量后每个样品取出100μg,利用TEAB缓冲液及超滤离心管进行溶液置换,二硫键还原及烷基化反应,然后每个样品分别加入1μg胰蛋白酶,37℃进行过夜酶解。3. iTRAQ标记、磷酸化多肽富集以及样品脱盐处理酶解产物经冻干及重溶,利用iTRAQ标记物(113,114,115,116,121)分别针对不同实验重复及不同组的样品进行标记(121标记所有组混合而成的内标),然后用超纯水终止标记。标记产物进行混合后再经冷冻干燥,利用基于二氧化钛(Ti02)的IMAC技术对磷酸化多肽进行富集,并洗脱非磷酸化多肽。所得富集产物再利用C18填充的固相萃取柱进行脱盐处理。4.液相分离及质谱检测利用水相为流动相,用C18富集柱对多肽样品进行富集,然后用5-55%梯度的乙腈在C18分析柱中洗脱样品90min。多肽经Nanospray Ⅲ source被电离及雾化后进入质谱进行检测,收集母离子及子离子信号,经过ProteinPilot Softwarev.4.5软件进行离子峰提取,然后利用Mascot引擎进行蛋白质数据库检索,并生成随机序列的诱饵库将假阳性率控制在1%之内。5.相对定量及生物信息学分析从所有鉴定的磷酸化多肽中筛选出在三次实验重复中都出现的多肽,然后将报告离子信号与内标均一化。以同一蛋白的不同磷酸化多肽的母离子信号峰面积为权重,再取均一化后带权重的iTRAQ报告离子强度平均值,每条磷酸化多肽报告离子强度除以其平均值得到相对磷酸化多肽强度,以此数据为基础再进行min/max转换(-1到1之间),然后进行单因素方差分析。对差异的磷酸化蛋白利用R语言clusterProfiler包分别对其进行KEGG通路富集以及GO功能富集。6.差异磷酸化修饰的Western-blot验证收集染毒处理的正常L-02细胞及SET-siRNA稳定干扰的L-02细胞,提取总蛋白并进行蛋白定量。根据蛋白定量结果,等量上样进行SDS-PAGE凝胶电泳。电泳完成后,将样品转移至PVDF膜上,再分别孵育nucleolin、4E-BP1 (phospho T46)、MCM2、MCM2 (phospho S139)以及GAPDH抗体,然后加相应二抗进行孵育,最后将PVDF膜进行曝光、图像处理及统计学分析。二、三氯乙烯致肝细胞毒性中SET介导的nucleolin自调控机制研究1. Western-blot验证nucleolin整体磷酸化及其表达水平变化收集染毒处理的正常L-02细胞及SET-siRNA稳定干扰的L-02细胞,提取总蛋白并进行蛋白定量。根据蛋白定量结果,等量上样进行Phos-tag-SDS-PAGE凝胶电泳。电泳完成后将样品转移至PVDF膜上,再分别孵育nucleolin以及GAPDH抗体,然后加相应二抗进行孵育,最后将PVDF膜进行曝光、图像处理及统计学分析。2. C-myc被抑制后nucleolin在L-02细胞中的表达变化L-02细胞在37℃,5%CO2条件下分别贴壁培养于六孔板中,待融合度达到75%以上,加入不同浓度(0μM、20 μM、40 μM、80 μM、100 μM)的c-myc抑制剂处理24h,然后用Western-blot分别检测c-myc与nucleolin蛋白表达水平的变化。3.在三氯乙烯作用下SET介导的c-myc与nucleolin相互作用的变化收集染毒处理的正常L-02细胞及SET-siRNA稳定干扰的L-02细胞,提取总蛋白并进行蛋白定量。按照Co-IP试剂盒说明,将nucleolin与c-myc抗体分别与A/G Plus琼脂柱进行结合,使抗体交联在琼脂柱上,每组等量上样后,分别以nucleolin与c-myc为诱饵蛋白进行免疫共沉淀实验,被沉淀的蛋白用Western-blot分别检测c-myc与nucleolin水平变化。三、三氯乙烯诱导的L-02肝细胞毒性中SET介导的转录组学研究1.细胞处理、荧光标记及芯片杂交L-02细胞与SET-siRNA稳定干扰的L-02细胞分别用8 mM三氯乙烯处理24小时,收集细胞,提取总RNA,按照Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit、Eukaryotic Hybridization Control Kit、Hybridization, Wash, and Stain Kit试剂盒说明配制所需荧光标记及清洗试剂,然后进行荧光标记、杂交及扫描。2.质量控制、相对定量及通路变异分析利用R语言包Affy进行质量控制。不同探针针对同一个基因取信号强度的中位数,同一个基因不同转录本取信号强度的总和,然后利用线性模型及贝叶斯统计检验对基因转录水平进行相对定量分析。为了进一步探索SET可能介导的通路变化,利用基因集变异分析(GSVA)算法筛选被激活／抑制的通路。实验结果一、三氯乙烯诱导的L-02肝细胞毒性中SET介导的磷酸化蛋白质组学研究1.共鉴定了107个磷酸化蛋白以及1878个磷酸化位点,其中1647个磷酸化位点未被收录在Phospho.ELM及PhosphoSitePlus两个主要磷酸化位点数据库中,可能是未见报道的新磷酸化位点。2.在鉴定的磷酸化蛋白中,有37个蛋白的44个磷酸化修饰位点在三组细胞的对比分析中(第一组：L-02细胞经三氯乙烯处理；第二组；正常L-02细胞与SET-siRNA稳定干扰的L-02细胞；第三组：SET-siRNA稳定干扰的L-02细胞经三氯乙烯处理)均发生了不同程度的改变,并具有统计学意义(P0.05)。3.13个蛋白的14个磷酸化位点在第一组与第三组细胞中变化趋势相反,结果显示,它们是三氯乙烯致肝细胞毒性中SET介导的差异磷酸化蛋白。4.差异磷酸化蛋白的功能性富集显示其涉及5条相关通路、33种不同的分子功能、159个不同的生物学进程以及51种不同的细胞组分,分析发现这些磷酸化蛋白大部分为核蛋白且与转录调控功能相关。5.在差异磷酸化蛋白中,利用Western-blot验证了4E-BP1(T46) (2.52±0.23、 2.65±0.44、1.35±0.21, P=1.268e-10)和MCM2 (S139) (0.34±0.07、0.75 ±0.08、4.50±1.07, P=5.714e-11)磷酸化修饰的变化。其中4E-BP1(T46)在三氯乙烯处理的L-02细胞与SET-siRNA稳定干扰的L-02细胞中磷酸化水平均呈上升趋势,但变化的幅度不同；MCM2(S139)在三氯乙烯处理的L-02细胞与SET-siRNA稳定干扰的L-02细胞中的磷酸化水平均显著性降低,但下降的幅度不一样。二、三氯乙烯致肝细胞毒性中SET介导的nucleolin自调控机制研究1.结果显示,Nucleolin在正常L-02细胞中经三氯乙烯处理后其整体磷酸化程度降低,而在SET-siRNA稳定干扰的L-02细胞中经三氯乙烯处理后其整体磷酸化程度升高。但检测nucleolin蛋白表达水平时,发现SET介导的其表达水平趋势与整体磷酸化改变趋势相反。2. Nucleolin的转录因子c-myc被抑制的结果显示,c-myc表达水平下降,同时nucleolin表达水平也随之下降。3. Co-IP及Western-blot检测结果显示,c-myc与nucleolin之间存在相互作用,且它们的结合在正常L-02细胞经三氯乙烯处理后减少,而在SET-siRNA稳定干扰的L-02细胞经三氯乙烯处理后增加,其变化趋势与表达水nucleolin平变化相反,而与其整体磷酸化修饰变化趋势相同。三、三氯乙烯诱导的L-02肝细胞毒性中SET介导的转录组学研究1.质控结果显示,经对数转换后芯片之间总体信号强度没有偏离,且RNA降解测试显示,样品中没有明显的RNA降解存在。2.4个基因在正常L-02细胞及稳定干扰的L-02细胞经三氯乙烯染SET-siRNA毒处理后均被检测到差异表达,其中有1个基因表达变化在两种细胞中呈相反方向；39个基因在第一组与第二组细胞间变化均不明显(P0.01)而在第三组细胞间表达显著变化(P0.01),因此,这些变化可能是SET介导的基因表达变化。3.经分析,SET介导的差异表达基因与STRING及c-myc蛋白相互作nucleolin用发现,酪氨酸-3单氧化酶／色氨酸-5单氧化酶激活蛋白高亲和受体蛋白Fc片段114-3-3 tau (YWHAQ)、IgE以及睫状神经生长(FCER1G)因子受体均为细胞凋亡相关蛋白,同时(CNTFR)与YWHAQ都CNTFR与和c-myc相关。nucleolin基因集变异分析发现,在第一组细胞中,13条通路被抑制,7条通路被激活；在第二组细胞中,5条通路被抑制,3条通路被激活；在第三组细胞中,1条通路被激活。结论1.鉴定了107个磷酸化蛋白以及1878个磷酸化位点,其中38个磷酸化蛋白的51个位点的磷酸化修饰在不同组中均发生了不同程度的改变,其中SET介导了13个蛋白的14个磷酸化位点改变。并验证了三氯乙烯诱导的4E-BP1(T46)和MCM2(S139)磷酸化修饰的变化。2. SET在三氯乙烯诱导的L-02细胞毒性中介导了nucleolin的整体磷酸化修饰,并以此影响nucleolin与c-myc蛋白的相互结合,从而导致nucleolin蛋白表达的自调控过程。3. 在三氯乙烯诱导的L-02细胞毒性中,nucleolin与c-myc的相互作用可能参与调控SET介导的YWHAQ、FCERIG及CNTFR等凋亡相关基因的转录。同时,SET蛋白还可能参与激活三氯乙烯L-02细胞毒性中Thrombin-Par4信号通路。

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