微小RNA-647在胃癌中的作用及相关机制研究
本文选题：miR-647 + 胃癌 ； 参考：《广西医科大学》2017年博士论文
【摘要】：1背景与目的胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内,胃癌位居肿瘤死亡的第二位。中国是胃癌高发国家,全世界每年新发生的胃癌为75.5万例,约35%发生在中国;胃癌的早期症状不明显,确诊胃癌时约有40%的患者已经伴有远处转移。目前临床上主要运用放疗,化疗,手术等手段治疗胃癌,但其总体死亡率并没有得到明显下降,进展期胃癌肿瘤组织的快速生长和远处转移是引起胃癌高死亡率的主要原因。与传统治疗相比,基因治疗具有靶向精准,特异性强,副作用小等优点,2004年1月我国研发的用于头颈部治疗肿瘤治疗的重组p53腺病毒注射液,在全球率先上市。尽管大量的研究已经报道了胃癌发生发展的机制,但是其发病的病理生理学改变仍不明确。因此,进一步探索胃癌发生发展的靶向治疗因子是早期诊断和治疗胃癌以及降低其死亡率的重要突破口。近年研究发现,微小RNA(miRNA、micro RNA)作为内源性非编码RNA具有靶向抑制其下游基因表达的生物学特性,与细胞增殖、转移、凋亡等生物进程相关,调控包括肿瘤在内的多种人类疾病,有望成为肿瘤治疗的靶向基因。由于micro RNA可靶向调控数百个基因的表达,其在恶性肿瘤的诊断和治疗方面显示出了非常好的应用前景。近年研究发现,miRNAs参与调节包括胃癌在内的多种肿瘤的生长和转移,同时Rawlings-Goss等发现miR-647与多种肿瘤相关并能作为胃癌发生发展的生物学标记物,但作用机制尚不明确。为进一步探讨miR-647在胃癌发生发展的作用,本研究首先拟通过荧光定量PCR方法检测人胃癌组织、人胃癌细胞株中miR-647表达情况,并分析其表达与临床病理特征(年龄、性别、肿瘤大小、转移和病理分型等)的相关性,以期明确miR-647表达在胃癌诊断和预后中的意义。进一步构建miR-647过表达慢病毒载体,通过体内实验与体外实验观察miR-647对胃癌细胞的作用,运用基因芯片、生物学预测软件、荧光定量PCR和Western Blot蛋白印记实验探讨其作用机制,以期明确miR-647在胃癌发生发展中的作用与机制。2方法2.1提取胃癌组织与胃癌细胞的总RNA(Trizol法),应用荧光定量PCR比较胃癌组织与正常癌旁组织,胃癌细胞与正常胃黏膜上皮细胞中miR-647的表达情况,进一步分析miR-647表达与胃癌患者临床病理特征(年龄、性别、肿瘤大小、转移和病理分型等)的相关性;Transwell检测人胃癌细胞株HGC-27、AGS、SGC-7901、MGC-803的侵袭能力。2.2构建miR-647过表达的慢病毒载体,阳性重组克隆进行序列验证;采用miR-647过表达的慢病毒载体转染人胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803,其中空白组(Ctrl组)不做任何处理常规培养细胞,阴性组(NC组)转染空病毒载体,实验组(647组)转染miR-647过表达的慢病毒载体,嘌呤霉素筛选成功转染的细胞株,荧光定量PCR检测转染胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803中miR-647的表达;CCK-8法检测miR-647过表达对胃癌细胞增殖的影响;流式细胞检测miR-647过表达对胃癌细胞周期和凋亡的影响;电镜下观察miR-647对胃癌细胞的微观形态改变;将成功转染miR-647过表达慢病毒颗粒的人胃癌细胞株细胞悬液100ul(2x107个/ml)接种于5~6周裸鼠腋下(8只/组),每三天测量瘤体长短径一次并计算肿瘤大小,21天后脱颈法处死裸鼠,HE法确认肿瘤组织。2.3划痕实验与Transwell实验分别检测miR-647对人胃癌细胞迁徙能力和侵袭能力的影响;将成功转染miR-647过表达慢病毒颗粒的人胃癌细胞株细胞悬液100ul(8x105个/ml)注射入5~6周龄裸鼠尾静脉(10只/组),36天后脱颈法处死裸鼠,HE染色检测胃癌转移模型的肝肺转移情况。2.4采用人类全基因组表达芯片谱检测miR-647过表达后人胃癌MGC-803的差异表达基因;生物信息学软件预测miR-647的靶基因;荧光定量PCR和Western Blot蛋白印迹实验检测miR-647预测靶基因ANK2以及其下游FAK、MMP2、MMP12、CD44、SNAIL1的m RNA与蛋白的表达情况。3.结果3.1荧光定量PCR结果显示,与对应癌旁正常组织相比,在70例胃癌患者中43例患者胃癌组织中miR-647表达量下降,占61.43%;在70例胃癌病人中,与对应癌旁正常组织相比,miR-647表达量明显下调(P0.05);与胃黏膜正常细胞株GES-1相比,miR-647在人胃癌细胞株HGC-27,AGS,SGC-7901和MGC-803中表达下调(P0.05),Transwell结果显示,与胃癌细胞株HGC-27和AGS相比,SGC-7901和MGC-803具有更强的侵袭能力且miR-647表达量与侵袭能力呈负相关(P0.05)。临床病理资料分析结果表明miR-647的表达量与胃癌组织的肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移和远处转移有关(P0.05)。3.2阳性重组克隆测序结果显示miR-647过表达载体序列正确;荧光定量PCR显示,miR-647过表达慢病毒载体转染人胃癌细胞株SGC-7901、MGC-803后miR-647表达量上调(P0.05);CCK-8法提示,与NC组与Ctrl组相比,miR-647过表达的647组SGC-7901和MGC-803的细胞增殖能力降低(P0.05);流式细胞仪检测显示与NC组与Ctrl组相比,miR-647过表达的647组SGC-7901和MGC-803的细胞周期阻滞在G0/G1期(P0.05),凋亡率增加(P0.05);透射电镜提示在647组SGC-7901和MGC-803中能观察到细胞凋亡的典型特征;裸鼠瘤体内实验显示,与NC组与Ctrl组相比,miR-647过表达的647组SGC-7901和MGC-803的裸鼠皮下移植瘤模型生长较慢(P0.05);HE染色显示皮下移植瘤体为恶性肿瘤组织。3.3划痕实验结果显示,与NC组与Ctrl组相比,miR-647过表达的647组SGC-7901和MGC-803细胞迁移能力下降(P0.05);Transwell实验结果显示,与NC组与Ctrl组相比,miR-647过表达的647组SGC-7901和MGC-803细胞侵袭能力下降(P0.05);转移瘤模型结果显示,与NC组(50%)与Ctrl组(70%)相比,miR-647过表达的647组SGC-7901细胞肝转移率为10%,转移率明显降低(P0.05)。3.4全基因组检测31741个基因,803-647与803-NC组相比,一共223个基因差异性表达(筛选条件为log2"#Flod change"#"g1.5,P㩳0.05),其中上调基因数为113个,下调基因数为110个;miRanda,Target Scan和micro RNA三个生物学预测软件显示,至少两个预测软件预测的miR-647的靶基因交集有382个;芯片表达差异下调基因和生物信息学软件预测靶基因的交集为ANK2、ZNF609、KNDC1和TRIM4;荧光定量PCR显示,ANK2与KNDC1在SGC-7901和MGC-803两株细胞中均下调(P0.05);由于只有ANK2与肿瘤发生相关,我们拟定ANK2为miR-647的下游靶基因的研究对象;同时Western Blot结果表明miR-647在SGC-7901和MGC-803两株细胞细胞中抑制ANK2蛋白表达(P0.05);荧光定量PCR和Western Blot蛋白印迹实验结果显示,与NC组与Ctrl组相比,miR-647过表达的647组中miR-647下游FAK、MMP2、MMP12、CD44、SNAIL1的m RNA与蛋白表达均下调(P0.05)。4.结论4.1 miR-647在胃癌组织中的表达低于癌旁正常组织,且与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移和远处转移有关;miR-647在胃癌细胞株中的表达低于胃黏膜正常上皮细胞株且其表达量与细胞的侵袭能力呈负相关。4.2成功构建miR-647过表达慢病毒载体与miR-647过表达人胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803;miR-647过表达在体外能抑制人胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803的增殖,使细胞发生G0/G1期阻滞,凋亡增加;同时,在体内能抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生长。4.3 miR-647过表达能在体内外抑制人胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803的转移能力。4.4 ANK2可能为miR-647的直接靶基因,miR-647过表达可使人胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803的ANK2和FAK、MMP2、MMP12、CD44、SNAIL1的m RNA与蛋白表达降低。创新点1.微小RNA与细胞增殖、转移、凋亡等生物进程密切相关,调控包括肿瘤在内的多种人类疾病,本研究通过检测miR-647在胃癌组织中的表达,并进一步分析其与临床病理特征的关系,初步阐明了miR-647在胃癌发生发展中的作用。2.本研究应用分子生物学技术构建目的miR-647的慢病毒载体,从增殖和转移两个方面观察其对胃癌细胞生物学行为的影响,并进一步探讨miR-647在胃癌发生和发展中的作用机制,以期为胃癌的早期诊断和治疗提供新的方向。
[Abstract]:In recent years , it has been found that microRNAs ( miRNA , micro RNA ) can be used as endogenous non - coding RNAs to treat gastric cancer . The expression of miR - 647 in gastric cancer cells was determined by fluorescence quantitative PCR , and the expression of miR - 647 in gastric cancer cell line SGC - 790and MGC - 803 was detected by MTT assay . The expression of miR - 647 overexpression in gastric cancer cell line SGC - 790and MGC - 803 was detected by immunohistochemistry . The expression of miR - 647 was detected by fluorescence quantitative PCR and Western Blot . Compared with the control group , the expression of miR - 647 was decreased ( P0.05 ) . Compared with the control group , the expression of miR - 647 was decreased ( P0.05 ) . Compared with the control group , the expression of miR - 647 was decreased ( P0.05 ) . The expression of miR - 647 in gastric cancer cells was lower than that of normal epithelial cells in gastric cancer .
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.2
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 戴成雨;胃癌20例误诊分析[J];实用医学杂志;2002年03期
2 李秋波,陶智慧,胡奎,韩智,马勇;胃癌术前区域动脉灌注化疗加手术联合治疗的疗效观察(附24例)[J];航空航天医药;2003年03期
3 倪海滨,毛振彪,黄介飞,肖明兵,季颖林,张彦亮,冒海蕾;血清可溶性细胞间粘附分子-1与胃癌临床意义的研究[J];南通医学院学报;2003年01期
4 邢亚莉;姚春霞;唐晓君;刘春梅;;彩超在胃癌诊断中的价值[J];基层医学论坛;2007年17期
5 ;日本专家用新技术提高胃癌诊断准确率[J];生物医学工程与临床;2009年02期
6 ;新技术能提高胃癌诊断准确率[J];中华中医药学刊;2009年07期
7 高春光;;胃癌患者的临床治疗体会[J];中国民族民间医药;2009年14期
8 高瑞凤;朱晔;刘兴姣;;37例进展期胃癌的超声分析[J];中国实用医药;2010年25期
9 姜可伟;;规范全球第二大致死率疾病的诊断——《胃癌诊断标准》解读[J];中国卫生标准管理;2010年04期
10 张常华;何裕隆;詹文华;吴英;;多学科小组与胃癌诊治[J];现代肿瘤医学;2011年06期
相关会议论文 前10条
1 武淑兰;魏志杰;殷宇明;;胃癌致微血管病性溶血性贫血的诊断[A];第十一届全国红细胞疾病学术会议暨学习班论文汇编[C];2007年
2 丁涛;;超声在诊断胃癌中的应用[A];中国超声医学工程学会第三届全国肌肉骨骼超声医学学术交流会论文汇编[C];2011年
3 陈晓康;吕国荣;苏若瑟;;应用彩色能量多普勒血流显像对胃癌的诊断价值[A];庆祝中国超声医学工程学会成立20周年——第八届全国超声医学学术会议论文汇编[C];2004年
4 于吉人;;胃癌的术前系统评估[A];2004年浙江省外科学学术年会论文汇编[C];2004年
5 杨军乐;宁文德;董季平;徐敏;;多层螺旋CT在胃癌诊断中的应用研究[A];中华医学会第十三届全国放射学大会论文汇编（下册）[C];2006年
6 张晓鹏;;胃癌磁共振成像研究进展[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议教育集[C];2006年
7 张丽红;常维平;黄贤会;;螺旋CT在特殊部位胃癌诊断中的应用[A];中国医师协会放射医师分会首届会员大会暨第四届医学影像山东论坛、山东省第16次放射学会议暨山东省第14届医学影像学学术研讨会论文集[C];2007年
8 陈静;;彩色多普勒超声检查在胃癌的应用[A];中国超声医学工程学会第七届全国腹部超声学术会议学术论文汇编[C];2007年
9 刘池波;梁勇;王海宝;杨林军;梁津逍;;胃癌患者中血清淀粉样蛋白A的测定及临床意义[A];第二届中国医学细胞生物学学术大会暨细胞生物学教学改革会议论文集[C];2008年
10 吴厚宾;;腹腔镜在胃癌诊治中的应用进展(综述)[A];江西省第二届胃肠外科学术会议暨江西省第十二次中西医结合普通外科学术会议论文汇编[C];2012年
相关重要报纸文章 前10条
1 钱铮;新技术能提高胃癌诊断准确率[N];中国中医药报;2009年
2 记者 陈青;胃癌患者从“存活”迈向“乐活”[N];文汇报;2010年
3 李楠;胃癌诊断敏感性从不足30%提高到57.4%[N];健康报;2008年
4 通讯员 李楠;胃癌“转化医学”研究见成效[N];上海科技报;2008年
5 记者 楚燕 通讯员 那伟 高树灼;厦门胃癌研究达国际领先水平[N];厦门日报;2009年
6 胡德荣;新型胃癌分子标志物研究获突破[N];中国医药报;2010年
7 本报记者 周芳;改善饮食习惯 早发现早治疗[N];吉林日报;2006年
8 中南大学湘雅二医院 杨燕贻;胃癌防治有哪些错误观念[N];大众卫生报;2005年
9 特约记者 程守勤;胃癌诊断又有新方法[N];家庭医生报;2003年
10 重庆万州 黄琼;胃癌的手术治疗[N];上海中医药报;2013年
相关博士学位论文 前10条
1 孙大志;基于microRNA 21的调控作用探讨从痰论治胃癌的作用机制[D];中国人民解放军医学院;2012年
2 陈悦之;TNFAIP8在胃癌中的表达和对调节胃癌细胞增殖，，影响侵袭及迁移中的作用研究[D];山东大学;2015年
3 殷继鹏;肿瘤血管靶向肽GX1用于胃癌的分子影像研究[D];第四军医大学;2015年
4 蔡习强;TFEB介导的自噬在胃癌耐药中的作用及其机制研究[D];第四军医大学;2015年
5 赵晓迪;microRNA-7调控胃癌恶性生物学行为的功能与分子机制研究[D];第四军医大学;2015年
6 尚华;MicroRNA-125a在胃癌中表达水平的研究及其临床意义[D];山东大学;2015年
7 关中正;TGF-β在胃癌免疫逃逸中作用及机制研究[D];山东大学;2015年
8 黄勇;AEG-1/MT qDH、NF-κB、MMP-9在胃癌中的表达及相关性的研究[D];山东大学;2015年
9 谢黎明;胃癌中miR-124表达的意义及作用机制研究[D];南华大学;2015年
10 刘佳宁;SOX9和CEACAM1在胃癌组织中表达及其对胃癌细胞增殖和转移的影响[D];山东大学;2015年
相关硕士学位论文 前10条
1 徐海蓉;胃癌危险因素的流行病学研究[D];南京医科大学;2002年
2 张军利;p27、PTEN与VEGF蛋白在胃癌组织中的表达及其意义[D];泰山医学院;2014年
3 马春婷;胃癌与幽门螺杆菌的相关性研究[D];石河子大学;2015年
4 王士杰;腹腔镜手术治疗进展期远端胃癌的临床疗效及患者术后随访生存质量研究[D];中国人民解放军医学院;2015年
5 李浩;胃癌血清蛋白标记物的筛选与鉴定[D];郑州大学;2015年
6 王巍;胃癌患者血液样品的光谱分析[D];郑州大学;2015年
7 李玉博;高场磁共振在胃癌术前T分期与分级的价值[D];郑州大学;2015年
8 张苏钰;SOX4和P53蛋白在胃癌组织中的表达及贞芪扶正胶囊对胃癌术后辅助治疗作用的观察[D];兰州大学;2015年
9 马来阳;能谱CT成像在胃癌术前分期及分化程度评价中的应用研究[D];兰州大学;2015年
10 侯向红;HORMAD2在胃癌中的表达及对胃癌细胞增殖和凋亡的影响[D];兰州大学;2015年
本文编号：1854079
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/yxlbs/1854079.html
