miR-148a-3p在膀胱癌中的抑癌作用及其分子机制研究

发布时间：2018-05-09 01:42

本文选题：膀胱癌 + 微小RNA　；参考：《浙江大学》2017年博士论文

【摘要】：背景:膀胱癌是危害人类健康的重要问题之一,在世界范围内,膀胱癌的发病率在所有恶性肿瘤中居于第九位,其中,在男性恶性肿瘤中位于第六位,在女性恶性肿瘤中位于第十位以后。我国膀胱癌的发病率与欧美国家相比相对较低,但随着社会老龄化的加剧、人们生活方式的转变以及新型分子标记物和影像学技术的应用,近年来我国膀胱癌的发病率及检出率呈快速上升趋势。最新数据显示,我国男性膀胱癌发病率居于所有恶性肿瘤第七位,女性膀胱癌发病率则居于十五位以外。膀胱癌的肿瘤生物学行为复杂,具有易复发、易转移等特点,数据表明,大约三分之一的初发膀胱癌会发生局部进展和远处转移,其5年生存期低于62%。遗传学改变和环境改变在膀胱癌的发生发展过程中发挥重要的作用,但由于混杂因素众多,如何研究并从中筛选出潜在方向,以阐明膀胱癌的致病机理,对于早期诊断和治疗膀胱癌,提高患者生存期具有重要的临床意义。microRNA(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸长度的、内源性、非编码的小RNA分子,这些miRNA通过与靶基因的3'非编码区不完全互补配对以调控靶基因的表达。越来越多的研究表明miRNA异常表达与膀胱癌的进展和转移有关。目的:在膀胱癌组织以及膀胱癌细胞株中利用原位杂交及荧光定量PCR法检测miR-148a-3p的表达情况,并进一步探索miR-148a-3p表达下调的表观遗传学机制。采用获得性功能实验观察miR-148a-3p在膀胱癌细胞系T24和UM-UC-3中的生物学功能。利用表达谱芯片、生物信息学预测和荧光素酶双报告系统寻找并验证miR-148a-3p的直接作用靶点,通过分析靶点基因的生物学功能,验证miR-148a-3p对其调控机制及价值,并进一步探索及研究潜在的下游分子信号通路。方法:1)通过人膀胱癌组织芯片和microRNA探针原位杂交实验,评估miR-148a-3p在膀胱癌组织中的表达情况,并分析miR-148a-3p表达下调是否和启动子区高甲基化有关;2)通过转染miR-148a-3p模拟体(mimic)上调miR-148a-3p表达量来进行获得性功能实验。通过CCK-8、平板克隆形成、流式细胞周期检测、裸鼠UM-UC-3细胞株皮下移植瘤模型和Transwell实验等方法来探索上调miR-148a-3p的表达对于细胞增殖和迁移侵袭能力的影响;3)利用基因芯片和生物信息学在线预测网站对miR-148a-3p的直接作用的下游靶基因进行分析和预测,然后利用荧光定量PCR、Western Blot和免疫组化等实验方法证实靶基因mRNA和蛋白水平表达的变化,并利用荧光素酶双报告实验对miR-148a-3p的靶基因进行验证和鉴定,并进一步使用RNA干扰等实验来明确靶向调控关系和下游机制。结果:1)我们发现,癌组织和癌旁组织的miR-148a-3p表达量存在显著差异(P0.0001),miR-148a-3p在膀胱癌组织中呈现低表达。同时,我们利用免疫组化评估DNMT1在膀胱癌组织中的表达情况,结果显示,癌和癌旁组织中的DNMT1染色强度存在显著的统计学差异,DNMT1在膀胱癌组织中呈现高表达(P0.0001)。膀胱癌中,miR-148a-3p启动子区附近的CpG岛呈现高甲基化状态,这与miR-148a-3p在膀胱癌中的低表达密切相关。此外,DNMT1作为miR-148a-3p直接作用的靶基因,两者之间在同一批膀胱癌组织中的表达量呈负相关(r = 0.108,P = 0.041)。因此我们认为,DNMT1和miR-148a-3p在膀胱癌中通过建立一个正反馈通路来调节miR-148a-3p在膀胱癌中的表达。2)我们发现,上调miR-148a-3p的表达量能够显著抑制膀胱癌细胞的增殖、体外克隆形成、促进G1期周期阻滞,抑制迁移和侵袭能力。此外,上调miR-148a-3p的表达可抑制裸鼠UM-UC-3细胞株皮下移植瘤的生长。miR-148a-3p过表达可通过抑制AKT2/Snail通路来逆转膀胱癌细胞中的EMT进程。这些结果提示我们miR-148a-3p可能在膀胱癌的进展中发挥着重要的抑癌作用。3)我们发现miR-148a-3p可以直接调控ERBB3基因的表达。此外,下调ERBB3的表达量能够显著抑制膀胱癌细胞的增殖、体外克隆形成、促进G1期周期阻滞,抑制迁移和侵袭能力。此外,Kaplan-Meier生存分析发现ERBB3蛋白的表达量和患者的OS具有显著相关性(P=0.026)。我们进一步利用Cox比例风险回归分析建立模型(包含年龄、性别、病理分级、临床T分期、淋巴结转移)来评估miR-148a-3p,ERBB3和DNMT1表达量与OS的相关性,我们发现,ERBB3与患者的OS显著相关。同时,我们发现miR-148a-3p的表达与ERBB3的表达呈负相关(r=0.149,P =0.017),miR-148a-3p的表达与DNMT1 的表达呈负相关(r=0.108,P=0.041),DNMT1的表达与ERBB3的表达呈正相关(r=0.116,P=0.042)。这些结果提示我们ERBB3可能在膀胱癌的进展中发挥着重要作用。同时,我们发现miR-148a-3p可以通过靶向AKT2抑制膀胱癌细胞的增殖。4)我们发现,miR-148a-3p 通过抑制 ERBB3/AKT2/c-myc 和ERBB3/AKT2/Snail两条通路,抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。5)我们发现,在过表达c-myc蛋白的时候,miR-148a-3p的表达量发生明显下调,也就是说,miR-148a-3p/ERBB3/AKT2/c-myc通过建立正反馈调节通路调控膀胱癌的发生发展。结论:1)miR-148a-3p在膀胱癌组织中呈现低表达,其原因可能在于DNMT1和miR-148a-3p通过在膀胱癌中·建立一个正反馈通路来调节miR-148a-3p在膀胱癌中的表达。2)上调miR-148a-3p的表达量能够显著抑制膀胱癌细胞的增殖、体外克隆形成、促进G1期周期阻滞,抑制迁移和侵袭能力。此外,miR-148a-3p过表达可通过抑制AKT2/Snail通路来逆转膀胱癌细胞中的EMT进程。3)miR-148a-3p过表达可以显著抑制其靶基因ERBB3和AKT2的mRNA和蛋白水平,通过抑制ERBB3/AKT2/c-myc和ERBB3/AKT2/Snail两条通路,进一步抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。4)miR-148a-3p/ERBB3/AKT2/c-myc通过建立正反馈调节通路调控膀胱癌的发生发展。
[Abstract]:Background : Bladder cancer is one of the most important problems in human health . In the world , the incidence of bladder cancer is located in the sixth place in all malignant tumors . The incidence of bladder cancer in China is less than 62 % . Results : 1 ) We found that there was a significant difference in the expression of miR - 148a - p in bladder cancer tissues ( P < 0.01 ) . We found that the expression of miR - 148a - 3P can significantly inhibit the proliferation of bladder cancer cells and inhibit the migration and invasion ability . These results suggest that ERBB3 may play an important role in the progression of bladder cancer . At the same time , we find that miR - 148a - 3P can inhibit the proliferation , invasion and migration of bladder cancer cells by targeting AKT2 .

【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.14

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