miR-154-5p通过调控E2F5抑制前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的研究

发布时间：2018-05-24 15:16

本文选题：前列腺癌 + miR-154-5p　；参考：《南京医科大学》2017年博士论文

【摘要】：第一部分:miR-154-5p在前列腺癌组织中的表达情况及在前列腺癌细胞株增殖、侵袭和迁移中的作用。目的:研究前列腺癌组织和前列腺癌旁组织中miR-154-5p的表达,进而继续研究miR-154-5p在前列腺癌细胞株PC-3和DU145增殖、侵袭和迁移中的作用。材料和方法:在江苏省人民医院收集组织标本(包括15例前列腺癌旁组织和32例前列腺癌组织),使用qRT-PCR检测组织中miR-154-5p的表达情况。通过细胞增殖实验、细胞周期实验来分析评估miR-154-5p在前列腺癌细胞株PC-3和DU145的增殖、侵袭和迁移中的作用。结果:研究表明miR-154-5p在前列腺癌组织中的表达水平是下降的,但因样本量的局限性,并未显示其与Gleason评分及其临床分期有一定的相关性。Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)试剂盒被用来分析细胞的增殖能力。结果显示:实验组的癌细胞株的生长在转染96h后受到显著抑制(P0.05)。用流式细胞仪检测进行细胞周期分析,结果发现miR-154-5p mimics转染后实验组癌细胞的生长被明显抑制,G1期的细胞生长被明显阻滞(P0.05)。迁移和侵袭实验显示过表达miR-154-5p能明显抑制实验组癌细胞的迁移和侵袭能力。结论:本研究表明miR-154-5p在前列腺癌组织中的表达水平是下降的,miR-154-5p可作为一种肿瘤抑制因子影响前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,让前列腺癌细胞停留在G1期。第二部分:E2F5在前列腺癌细胞株的增殖、侵袭和迁移中的作用。目的:研究E2F5在前列腺癌组织中的表达及其对前列腺癌细胞生物学功能的影响。材料与方法:为了探讨PCA癌变过程中E2F5的生物学功能,我们针对E2F5基因的特异性构建了 3种siRNA(siE2F5-1,2,和3),并构建了人类基因序列无同源序列的RNA作为阴性对照组(NC),向PC-3细胞转染E2F5分子靶向siRNA(si-E2F5)和对照siRNA。通过实时荧光定量PCR和Western blot来分析每个siRNA对E2F5表达水平的影响。运用RNA干扰技术下调E2F5的表达水平后,使用细胞增殖实验、集落形成实验、细胞周期实验来分析E2F5下调后对前列腺癌细胞株PC-3和DU145的增殖、侵袭和迁移的影响。结果:前列腺癌细胞株PC-3和DU145被3种siRNA(siE2F5-1,2,和3)和对照siRNA转染48小时后,转染siE2F5-1和siE2F5-3的细胞中E2F5 mRNA的表达水平明显降低。在Western blot分析后发现siE2F5-3比siE2F5-1能更加有效抑制E2F5表达。所有的后续实验都是针对siE2F5-3的功能进行分析(以下简称siE2F5)。结果显示,实验组细胞株增殖能力比对照组细胞显著降低(P0.05)。流式细胞仪发现实验组癌细胞生长停滞于G1期,生长受到到显著抑制(P0.05)。被siE2F5转染96小时后,PC-3和DU145细胞的增殖率明显下降后,siE2F5转染组中PC3和DU145细胞处于G0/G1期的百分比较NC组相高。si-E2F5转染组中前列腺癌细胞的迁移和侵袭明显低于NC组细胞。结论:E2F5在前列腺癌组织中的蛋白表达水平明显较高。下调E2F5表达水平可抑制前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力。E2F5是前列腺癌癌变过程中重要的细胞周期蛋白,通过促进G0/G1期的转化进而促进细胞周期进展。第三部分:miR-154-5p靶基因E2F5的确定。目的:研究E2F5是否为mmiR-154-5p的直接靶基因。材料与方法:通过双荧光素酶报告基因实验确定miR-154-5p是否通过E2F5的3'-UTR区域直接调控E2F5。结果:向前列腺癌细胞株PC-3和DU 145细胞分别转染miR-154-5p mmimics和对照miRNA后72小时,miR-154-5p mimics转染组中E2F5蛋白水平显着下降。为了探讨miR-154-5p是否可以通过前列腺癌细胞的某个特定的结合位点直接调控E2F5,我们克隆了 miR-154-5p在荧光素酶基因的下游区域的预测结合位点。向前列腺癌细胞株中共转染miR-154-5p mimics或阴性对照后,miR-154-5p mimics能比对照组更加显著地抑制荧光素酶活性。此外,当细胞共转染miR-154-5p抑制剂和对照抑制剂,miR-154-5p抑制剂能比对照组更加明显增加的荧光素酶活性。这些结果表明,E2F5是miR-154-5p的直接靶基因。结论:E2F5是miR-154-5p的直接靶基因,参与了前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移的过程。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.25

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