MicroRNA-185-5p-STIM1通路对胃癌上皮间质转化影响及临床意义的相关研究

发布时间：2018-05-28 01:31

本文选题：基质相互作用分子1 + 上皮间质转化　；参考：《河北医科大学》2017年博士论文

【摘要】：胃癌是常见消化道肿瘤,全世界胃癌发病率在肿瘤发病率中排第四,胃癌致死率在全球肿瘤致死率中排在第二,胃癌中大概有50%的病人初次确诊即为进展期胃癌,五年生存率不到30%。目前,胃癌的侵袭性和转移机制仍然不是很清楚。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤转移早期中关键和必须的过程。在上皮间质化过程中,肿瘤细胞失去上皮细胞特征,包括E-cadherin的表达、细胞间的粘附、上皮细胞极性,获得间质细胞特征,包括迁移能力和侵犯性。有研究证实,在乳癌、结肠癌、膀胱癌、肺癌、胃癌中,EMT与肿瘤TNM高分期、高复发率以及低的生存率相关。micro RNA(miRNA)是一类内生的、高度保守的非编码小RNA,长度约22个核苷酸,与靶基因的3′UTR区域特异性结合,引起其降解或抑制其翻译,参与基因转录后表达水平的调控,在肿瘤发生、发展中起到了重要的作用。miRNA与肿瘤的转移密切相关,参与肿瘤转移级联,有望成为新的抗肿瘤转移治疗的方法。基质相互作用分子1(Stromal interaction molecule 1,STIM1)负责活化钙库操纵性钙内流(SOCE),在肿瘤细胞的生长、迁移、血管形成、侵袭中有重要的作用。STIM1通过SOCE作用于小RAS GTP酶、小RAC GTP酶以及钙蛋白酶调节粘着斑周转,从而对肿瘤细胞转移发挥作用。在结肠癌、乳腺癌、子宫内膜癌、几种类型肿瘤中STIM1是促进EMT的关键分子。胃癌中STIM1是否是miR-185-5p有相互作用,其相互作用机制以及在胃癌发展、转移中所起作用及具体机制目前不清楚。本研究以胃癌组织、胃癌细胞株为研究对象,应用常规病理、免疫组织化学、激光扫描共聚焦显微镜、细胞活性检测试剂盒(cell counting kit-8,cck8)、流式细胞术、Transwell小室、实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)、蛋白印迹法(western blot)等方法研究micro RNA-185-5p(miR-185-5p)在胃癌(及癌旁)组织中表达及其与胃癌临床病理特征的关系;研究miR-185-5p与基质相互作用分子1(Stromal interaction molecule 1,STIM1)在胃癌组织、胃癌细胞中表达的相关性;观察miR-185-5p在不同分化的胃癌细胞株中的表达;研究miR-185-5p对胃癌细胞钙池操纵性钙离子内流(Store-operated Ca~(2+)entry,SOCE)的影响及其对胃癌细胞生物学行为的影响;通过检测上皮间质转化标记物上皮钙黏附蛋白(E-cadherin),神经钙黏附蛋白(N-cadherin),波形蛋白(Viminten)的变化来研究miR-185-5p、STIM1、SOCE在胃癌上皮间质转化中的作用及其具体机制。研究STIM1在胃癌组织及胃癌细胞中的表达、临床病理意义及其对胃癌细胞生物学行为的影响。阐明miR-185-5p、STIM1、SOCE在胃癌增殖、侵袭和转移中的作用,为胃癌的分子靶向性治疗提供新的依据。本研究共分为三部分:第一部分miR-185-5p-STIM1-SOCE通路对胃癌细胞上皮间质转化影响的相关研究目的:验证胃癌细胞中miR-185-5p负性调控STIM1,探讨miR-185-5p对钙库操纵性Ca~(2+)内流的影响,探讨miR-185-5p与SOCE抑制剂SKF96365对胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭生物学行为的影响以及与胃癌细胞上皮间质转化的相关性。方法:1利用qRT-PCR和免疫组化方法检测胃癌组织中miR-185-5p和STIM1表达的相关性。qRT-PCR检测人胃粘膜上皮细胞GES-1和常见胃癌细胞株中miR-185-5p的表达。SGC-7901细胞转染miR-185-5p mimics和BGC-823细胞转染miR-185-5p inhibitor,利用qRT-PCR和Western-blot方法检测miR-185-5p和STIM1表达的相关性。2 SGC-7901细胞转染miR-185-5p mimics和BGC-823细胞转染miR-185-5p inhibitor,应用共聚焦显微镜检测miR-185-5p对钙库操纵性Ca~(2+)内流的影响。3通过CCK法检测miR-185-5p与SOCE抑制剂SKF96365对SGC-7901和BGC-823细胞的增殖情况。应用Transwell小室检测细胞miR-185-5p与SOCE抑制剂SKF96365对SGC-7901和BGC-823细胞的迁移、侵袭情况。4利用qRT-PCR和Western-blot检测miR-185-5p与SOCE抑制剂SKF96365对SGC-7901和BGC-823细胞上皮间质转化标记物上皮钙黏附蛋白、神经钙黏附蛋白、波形蛋白的影响。结果:1验证胃癌组织中miR-185-5p与STIM1表达相关性。胃癌组织中miR-185-5p表达量相对于癌旁组织显著低表达,与淋巴结转移和TNM高分期相关。STIM1免疫组化染色阳性标本中miR-185-5p表达明显低于STIM1免疫组化染色阴性标本,P=0.004。2 miR-185-5p在不同胃癌细胞株中的表达水平。以GES-1为对照,miR-185-5p在胃癌细胞SGC-7901、MKN-28、MGC-803、BGC-823、AGS为低表达。miR-185-5p在BGC-823细胞中表达相对稍高,在SGC-7901相对较低。转染miR-185-5p inhibitor敲低BGC-823中miR-185-5p表达、转染miR-185-5p mimics上调SGC-7901中miR-185-5p表达进行后续试验。3 miR-185-5p负性调控胃癌细胞STIM1表达水平。SGC-7901细胞中miR-185-5p过表达后,STIM1的m RNA和蛋白水平的表达量下降,与阴性对照组相比,P0.01。敲除BGC-823细胞的miR-185-5p表达后,STIM1的m RNA和蛋白水平的表达量上调,与阴性对照组相比,P0.01。4 miR-185-5p对钙库操纵性Ca~(2+)内流的影响。Fluo-4/AM荧光探针法检测过表达miR-185-5p的SGC-7901细胞和敲低miR-185-5p的BGC-823细胞中SOCE的变化。实验结果显示,过表达miR-185-5p的SGC-7901细胞,相对于阴性对照组,TG激活的Ca~(2+)振幅变化不明显(P0.05),加入钙离子激活的SOCE显著降低,有统计学意义,P0.01。敲低miR-185-5p的BGC-823细胞,相对于阴性对照组,加入TG后激活的Ca~(2+)振幅变化不明显,加入钙离子激活的SOCE显著增高,P0.01。5 miR-185-5p与SOCE抑制剂SKF96365对SGC-7901和BGC-823细胞增殖的影响。应用CCK8法对胃癌细胞BGC-823和SGC-7901增殖进行检测。SGC-7901细胞,相对于阴性对照组,miR-185-5p mimics组的增殖能力下降;阴性对照组、miR-185-5p mimics组的OD值24h时间点分别为0.736±0.0743、0.596±0.012,P=0.000;48h为0.826±0.0912 VS 0.663±0.0393,P=0.002;72h为0.816±0.159 VS 0.648±0.047,P=0.015。BGC-823细胞,相对于阴性对照组,miR-185-5p inhibitor组的增殖能力增强;阴性对照组、miR-185-5p mimics组的OD值24h时间点分别为1.538±0.087、1.673±0.123,P=0.031;48h为1.564±0.067 VS 1.994±0.397,P=0.007;72h为1.582±0.293 VS 2.02±0.185,P=0.003。在细胞培养液中加入终浓度为1.5u M的SOCE抑制剂SKF96365,上述miR-185-5p对胃癌SGC-7901、BGC-823的增殖能力的影响现象消失,P0.05。6 miR-185-5p与SOCE抑制剂SKF96365对SGC-7901和BGC-823细胞迁移的影响。在转染miR-185-5p mimcs或miR-185-5p inhibitor及阴性对照48h后,应用Transwell迁移模型对胃癌细胞SGC-7901和BGC-823迁移进行检测。SGC-7901的miR-185-5p mimics组迁移能力明显低于阴性对照组;BGC-823的miR-185-5p inhibitor组迁移能力明显高于阴性对照组,差异有统计学意义,P0.01。在同时予以SKF 96365处理后,上述的差异则不明显,P0.05。7 miR-185-5p与SOCE抑制剂SKF96365对SGC-7901和BGC-823细胞侵袭的影响。在转染miR-185-5p mimcs或miR-185-5p inhibitor及阴性对照48h后,应用Transwell侵袭模型对胃癌细胞SGC-7901和BGC-823迁移进行检测。SGC-7901的miR-185-5p mimics组侵袭能力明显低于阴性对照组;BGC-823的miR-185-5p inhibitor组侵袭能力明显高于阴性对照组,差异有统计学意义,P0.01。在同时予以SKF 96365处理后,上述的差异则不明显,P0.05。8 miR-185-5p与SOCE抑制剂SKF96365对SGC-7901和BGC-823的E-cadherin、N-cadherin、Viminten表达的影响。在转染miR-185-5p mimcs或miR-185-5p inhibitor及阴性对照24h后,应用qRT-PCR检测胃癌细胞SGC-7901和BGC-823中STIM1、E-cadherin、N-cadherin、Viminten的m RNA的表达。转染成功48h后,Western blot检测SGC-7901、BGC-823细胞STIM1、E-cadherin、N-cadherin以及Vimiten蛋白水平的表达。实验结果显示在miR-185-5p mimics升高SGC-7901细胞miR-185-5p表达后,STIM1和E-cadherin的m RNA和蛋白水平表达明显下降,而N-cadherin和Vimiten的m RNAh和蛋白水平表达明显升高,P0.01。利用miR-185-5p inhibitor抑制BGC-823细胞miR-185-5p的表达后,STIM1和E-cadherin的m RNA和蛋白水平表达明显升高,而N-cadherin和Vimiten的m RNA和蛋白水平表达则明显下降,P0.01。在给予SOCE抑制剂SKF96365后,在miR-185-5p过表达的SGC-7901细胞、miR-185-5p敲低的BGC-823细胞STIM1的m RNA和蛋白表达量与miR-185-5p表达成负相关,但上皮间质转化标记物E-cadherin、N-cadherin以及Vimiten的m RNA和蛋白表达相对于阴性对照组没有明显差异,P0.05。小结:1 miR-185-5p在胃癌细胞株、胃癌组织中低表达。胃癌组织中miR-185-5p表达量相对于癌旁组织显著低表达,与淋巴结转移和TNM高分期相关。胃癌组织中miR-185-5p与STIM1表达量呈负性相关。2 miR-185-5p mimics能成功转染SGC-7901,上调miR-185-5p表达。miR-185-5p inhibitor能成功转染BGC-823细胞,下调miR-185-5p的表达水平。3 miR-185-5p负性调控SGC-7901、BGC-823细胞的STIM1表达及SOCE振幅。4过表达miR-185-5p能抑制SGC-7901细胞的增殖,敲除miR-185-5p能促进BGC-823细胞的增殖。SOCE抑制剂SKF96365能消除miR-185-5p对SGC-7901和BGC-823细胞增殖的影响。5过表达miR-185-5p能抑制SGC-7901细胞的迁移及侵袭,敲除miR-185-5p能促进BGC-823细胞的迁移及侵袭。miR-185-5p对SGC-7901和BGC-823细胞迁移、侵袭的影响,在予以SOCE抑制剂SKF96365处理后没有统计学意义。6 miR-185-5p负性调控STIM1、SOCE来调节SGC-7901、BGC-823细胞的上皮间质转化。SOCE抑制剂SKF96365能消除miR-185-5p对SGC-7901和BGC-823细胞上皮间质转化的影响。第二部分STIM1对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及上皮间质转化影响的研究目的:研究STIM1对胃癌细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭等生物学行为的影响,验证STIM1与胃癌细胞上皮间质转化的相关性。方法:1利用qRT-PCR和Western-blot检测了人胃粘膜上皮细胞GES-1和常见胃癌细胞株中STIM1的表达。2选择胃癌细胞株中STIM1表达最高的BGC-823及相对较低的SGC-7901做后续的实验。采用瞬时转染的方法,将STIM1-si RNA或阴性对照转入SGC-7901、BGC-823,通过CCK法检测胃癌细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,应用Transwell小室检测细胞迁移、侵袭情况。3利用qRT-PCR和Western-blot检测STIM1对胃癌细胞上皮间质转化标志物上皮钙黏附蛋白、神经钙黏附蛋白、波形蛋白的影响。结果:1不同胃癌细胞株中STIM1的表达水平。相对于GES-1,STIM1在SGC-7901、MKN-28、MGC-803、BGC-823、AGS中过表达。BGC-823中STIM1表达最高,SGC-7901相对较低。2转染STIM1-si RNA的BGC-823和SGC-7901中STIM1表达水平。使用脂质体转染技术以STIM1-si RNA转染BGC-823和SGC-7901,再以qRT-PCR、Western-blot法检测STIM1的表达,结果显示转染STIM1-si RNA的BGC-823和SGC-7901中,STIM1表达显著低于阴性对照和空白对照组,P0.01,提示转染成功,可行后续试验。3敲除STIM1对胃癌细胞SGC-7901和BGC-823增殖的影响。在转染STIM1-si RNA及阴性对照24h、48h、72h后,应用CCK8法对胃癌细胞BGC-823和SGC-7901增殖进行检测。SGC-7901细胞24h NC组、si RNA组的OD值分别为0.809±0.073、0.801±0.0145,24h时间点无统计学意义,P=0.938;48h NC组、si RNA组的OD值分别为0.96±0.34、0.65±0.184,P0.05;72h NC组、si RNA组的OD值分别为0.938±0.259、0.874±0.215,P0.01。BGC-823细胞24h NC组、si RNA组的OD值分别为1.563±0.195、1.332±0.0654,P0.05;48h NC组、si RNA组的OD值分别为1.699±0.142、1.425±0.0389,P0.01。72h NC组、si RNA组的OD值分别为1.911±0.110、1.611±0.138,P0.05。4敲除STIM1对胃癌细胞SGC-7901和BGC-823凋亡的影响。在转染STIM1-si RNA及阴性对照48h后,应用流式细胞仪对胃癌细胞胃癌细胞SGC-7901和BGC-823凋亡进行检测。SGC-7901细胞NC组VS si STIM1组=4.753±0.15%VS 6.533±0.153%,P0.01。BGC-823细胞NC组vs si STIM1组=2.733±0.208%VS 6.763±0.764%,P0.01。5敲除STIM1对胃癌细胞SGC-7901和BGC-823迁移的影响。在转染STIM1-si RNA及阴性对照48h后,应用Transwell迁移模型对胃癌细胞胃癌细胞SGC-7901和BGC-823迁移进行检测。实验结果示SGC-7901细胞48h NC组迁移的细胞数为443.33±21.825,si STIM1组迁移的细胞数为133±15.716,P=0.000。BGC-823细胞NC组迁移的细胞数为642.67±31.342,si STIM1组迁移的细胞数为254.33±17.502,P=0.000。6敲除STIM1对胃癌细胞SGC-7901和BGC-823侵袭的影响。在转染STIM1-si RNA及阴性对照48h后,应用Transwell侵袭模型对胃癌细胞SGC-7901和BGC-823侵袭进行检测。实验结果示SGC-7901细胞48h NC组侵袭出的细胞为431±19,si STIM1组为94±11,P=0.000。BGC-823细胞NC组侵袭出的细胞为259±18,si STIM1为99±10。si STIM1组与NC组相比,P=0.000。7敲除STIM1对胃癌细胞SGC-7901和BGC-823的E-cadherin、N-cadherin、Viminten表达的影响。在转染STIM1-si RNA及阴性对照24h后,应用qRT-PCR检测胃癌细胞SGC-7901和BGC-823中STIM1、E-cadherin、N-cadherin、Viminten的m RNA的表达。实验结果显示SGC-7901和BGC-823细胞si STIM1组中,在STIM1被敲除后,N-cadherin、Viminten较NC组明显降低,P0.01,E-cadherin却明显升高,P0.05。在转染STIM1-si RNA及阴性对照48h后,应用Western-blot检测胃癌细胞SGC-7901和BGC-823中STIM1、上皮钙黏附蛋白、神经钙黏附蛋白、波形蛋白的蛋白表达。实验结果显示STIM1在敲除后,SGC-7901、BGC-823中N-cadherin、Viminten蛋白水平表达均显著下降,P0.01;而E-cadherin蛋白水平表达显著升高,P0.01。小结:1 STIM1在SGC-7901、MKN-28、MGC-803、BGC-823、AGS中过表达。2 STIM1-si RNA能成功转染SGC-7901和BGC-823细胞,能下调SGC-7901和BGC-823细胞中STIM1的表达水平。3下调STIM1表达能抑制SGC-7901和BGC-823细胞的增殖。4下调STIM1表达能促进SGC-7901和BGC-823细胞的凋亡。5下调STIM1表达能抑制SGC-7901和BGC-823细胞的迁移与侵袭。6下调STIM1表达后SGC-7901和BGC-823细胞发生了EMT逆转,即间质上皮转化。第三部分胃癌组织中STIM1的表达与上皮间质转化关系及临床意义目的:探讨基质间质分子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)在胃癌组织中的表达以及STIM1和上皮间质转化之间关系。方法:1选取河北医科大学第四医院外三科在2009年6月至2011年10月手术切除的170例胃腺癌和35例癌旁组织标本,术前未接受放、化疗,未同时合并其他肿瘤,运用免疫组化方法检测胃癌和癌旁标本组织中STIM1、E-cadherin和β-cadherin表达。2采用SPSS19.0进行统计学处理,采用卡方检验(2X检验)进行数据分析。采用Kaplan-Meier绘制生存曲线。采用二分类多因素logistics回归模型探讨影响STIM1阳性表达的因素。cox比例风险回归回归模型探讨影响患者死亡的因素并分析其与临床病理特点的相关性。结果:1 STIM1主要表达在胃癌组织的胞浆,STIM1在胃癌组织中阳性表达率为43.5%(74/170),明显高于癌旁组织(8.60%,3/35,χ2=15.12,P0.001)。2胃癌淋巴结转移阳性病人STIM1阳性表达率明显高于淋巴结转移阴性病人(P0.001)。TNM分期I/II期胃癌组织中STIM1阳性表达率为33.5%(17/57),明显低于III/IV(66.5%,57/113,P=0.01)。STIM1表达与性别、年龄、肿瘤分化程度、肿瘤位置、肿瘤大小不相关,P0.05。淋巴结转移是胃癌病人STIM1阳性表达的唯一独立危险因素。3使用Kaplan Meier分析,我们发现STIM1表达阳性的胃癌病人总生存率明显低于STIM1表达阴性的胃癌病人,P=0.043。多因素分析提示患者生存率明显相关的因素有STIM1阳性表达、淋巴结转移、高的TNM分期。cox比例风险回归模型显示STIM1阳性表达和淋巴结转移是胃癌病人的独立预后因素4 E-cadherin和β-catenin异常表达在胃癌细胞的胞浆或胞核,胃癌组织中,E-cadherin和β-catenin异常表达率分别为61.8%(105/170)、52.4%(89/170)。在癌旁组织中,E-cadherin和β-catenin异常表达率分别11.4%(4/35)和20.0%(7/35)。E-cadherin和β-catenin异常表达率在胃癌组织和癌旁组织中具有显著差异,P0.001。E-cadherin异常表达率与淋巴结转移、TNM高分期明显相关,P0.001,β-catenin异常表达率与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期明显相关,P0.001,与其他临床病理参数不相关,P0.05。5 STIM1阳性的胃癌组织中E-cadherin阳性率为78.4%(58/74)、β-catenin阳性率90.5%(67/74)。STIM1表达与E-cadherin(χ2=34.555,P0.001,κ=0.447)和β-catenin(χ2=45.947,P0.001,κ=0.486)异常表达显著相关。E-cadherin异常表达的胃癌组织中β-cadherin异常表达率为79.8%,E-cadherin异常表达与β-cadherin异常表达显著相关(P0.001);胃癌组织中STIM1表达与E-cadherin(P0.001)和β-cadherin(P0.001)异常表达显著相关。小结:1 STIM1在胃癌组织中表达明显高于癌旁组组。2胃癌组织中STIM1表达与淋巴结转移、高的TNM分期显著相关。3胃癌组织中STIM1表达阳性的病人总生存率明显低于表达阴性的胃癌病人。STIM1表达阳性和淋巴结转移是胃癌病人的独立预后因素。4胃癌组织中异常表达的E-cadherin和β-cadherin显著高于癌旁组织。5胃癌组织中STIM1表达与E-cadherin和β-cadherin异常表达显著相关。结论:1 miR-185-5p在胃癌细胞株、胃癌组织中低表达。STIM1在胃癌细胞株、胃癌组织中过表达。胃癌组织中miR-185-5p表达量相对于癌旁组织显著低表达,与淋巴结转移和TNM高分期相关。STIM1在胃癌组织中过表达,与淋巴结转移、高的TNM分期显著相关。胃癌组织中STIM1表达阳性的病人总生存率明显低于表达阴性的胃癌病人。STIM1表达阳性和淋巴结转移是胃癌病人的独立预后因素,miR-185-5p与STIM1表达量呈负性相关,miR-185-5p与STIM1可以成为胃癌转移的预测因素。2 miR-185-5p负性调控胃癌细胞的STIM1表达及SOCE振幅。3 miR-185-5p抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭。SOCE抑制剂SKF96365能消除miR-185-5p对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响。4敲除STIM1能抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭。5 STIM1促进了胃癌上皮间质转化:胃癌组织中STIM1表达与E-cadherin和β-cadherin异常表达显著。敲除STIM1,引起胃癌细胞上皮间质转化逆转,即间质上皮转化。6 miR-185-5p-STIM1-SOCE通路调节胃癌细胞的上皮间质转化。7 miR-185-5p,STIM1和SOCE可能成为抗胃癌侵袭转移治疗的新靶点。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.2

【参考文献】