常春藤皂甙元抗肝癌作用研究

发布时间：2018-05-31 13:41

  本文选题：常春藤皂甙元 + H22肝癌　； 参考：《西北农林科技大学》2017年博士论文

【摘要】：肝细胞癌(Hepatocellμlar Carcinoma,HCC)(简称肝癌)的发病率在所有恶性肿瘤中排在第二位,仅次于肺癌,其发病率因地区不同而有所差异,发达国家明显低于发展中国家,亚洲国家的发病率高于美国和西欧国家,在我国其发病率已超过25/10万,其中高发区之肝癌标准化发病率达49.17/10万人口。据统计,我国每年新增近30余万肝癌患者,占全世界每年新增肝癌患者的一半。另外,我国每年死于肝癌的病人约为30万人,患者5年生存率仅为2.7%。肝癌患病一般不易察觉、且发展迅速,患者的生存期短、后期生存质量较差。早期肝癌的治疗以手术治疗为首选并辅以放射疗法和或化学疗法;中晚期肝癌及转移性肝癌以放射疗法和或化学疗法为主,一般不建议手术。近年来,随着中药抗肿瘤研究的兴起,天然植物药在癌症治疗中受到了广泛的关注。在前期研究工作中,笔者曾对八月札水提物的抗肝癌作用进行了初步的研究,发现其能够明显降低H22荷瘤小鼠体内肿瘤的重量,对肝癌细胞的生长和增殖具有显著的抑制作用。同时,八月札水提物还能够显著提高H22荷瘤小鼠的免疫水平,提高机体抗氧化应激、清除自由基和维持内环境活性氧动态平衡的能力。由此推测,八月札水提物可能通过诱导肝癌细胞凋亡和上调机体免疫水平而发挥抗肿瘤作用。本研究将八月札的主效成份常春藤皂甙元(Hederagenin,HD)作为研究对象,并通过H22荷瘤小鼠体内试验和Hep G2细胞体外培养试验,应用MTT、RT-PCR、免疫荧光、Western Blot、AO/EB凋亡染色、Hoechst33342凋亡染色、酶联免疫吸附试验、NK细胞活性检测以及流式细胞术等方法,试图探讨HD抗肝癌作用及在肿瘤细胞调控、诱导细胞凋亡和免疫调节等方面的作用及相关机制,并获得如下结果。1.在HD对H22荷瘤小鼠抗肝癌作用的研究中,首先建立H22荷瘤小鼠模型,随机分为5组,每组12只,即对照组、环磷酰胺(CTX)阳性对照组、HD低剂量组(100mg/Kg)、HD中剂量组(200 mg/Kg)和HD高剂量组(400 mg/Kg)。经不同剂量的HD连续干预H22荷瘤小鼠14 d后,可观察到H22荷瘤鼠肿瘤组织的生长和增殖受到明显的抑制,小鼠的生存状态和生命体征与对照组比较得到明显的改善。HD各试验组(100mg/Kg、200 mg/Kg和400 mg/Kg)均能显著地抑制H22荷瘤小鼠肿瘤的生长(P0.01),肿瘤抑制率分别为29.67%、42.75%和40.26%。通过HE染色观察H22荷瘤小鼠肝脏和肾脏的组织结构,以及对肝和肾功能相关指标的检测,发现HD对小鼠无明显的毒副作用。通过免疫荧光法检测各试验组H22荷瘤小鼠肿瘤组织中突变型P53、P21和Bcl-2蛋白的表达情况,研究结果显示,对照组小鼠的肿瘤组织中突变型P53和Bcl-2蛋白呈高表达,而P21蛋白则相反呈现低表达。经HD和CTX处理后的小鼠肿瘤组织中突变型P53和Bcl-2蛋白的表达显著降低(P0.01),而P21蛋白的表达则显著升高(P0.01)。以上结果揭示HD可能通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。2.在HD诱导H22荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡作用研究中,应用免疫荧光、RT-PCR和Western blot等技术,对肿瘤组织中Bcl-2、Bax、Fas、Fasl、Caspase-3和Caspase-8基因在转录和翻译水平的表达进行了研究。与对照组比较,HD各试验组H22荷瘤小鼠肿瘤组织细胞中Bcl-2在转录和翻译水平的表达均显著降低(P0.01),而Bax、Fas、Fas L、Caspase-3、Caspase-8在转录和翻译水平的表达均显著升高(P0.01)。以上结果揭示HD可能通过激活细胞凋亡的线粒体途径和死亡受体途径诱导肿瘤细胞凋亡,从而发挥其抗肿瘤作用。3.在HD对H22荷瘤小鼠免疫功能的影响研究中,通过分析HD治疗前后小鼠免疫器官组织结构和功能的变化,发现HD各试验组均可以明显的改善H22荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数(P0.05),初步判定HD能够促进H22荷瘤小鼠胸腺和脾脏两大免疫器官的修复。同时,HD能够显著提高H22荷瘤小鼠脾淋巴细胞的增殖能力(P0.01),显著提高小鼠免疫器官中的NK细胞的杀伤能力(P0.05);HD能够显著增加CD4+T淋巴细胞的数量,提升CD4+/CD8+的比值(P0.05),表明HD能通过调节T淋巴细胞亚群的数目和比例进而改善细胞免疫应答。另外,HD还能够调节H22荷瘤小鼠外周血中IL-2和TNF-α的表达水平,尤其HD 200 mg/Kg和400 mg/Kg组作用显著(P0.05)。以上结果揭示HD可能通过修复免疫器官、调控细胞免疫应答和改善细胞因子水平而发挥抗肿瘤作用。4.在HD体外抑制Hep G2细胞作用的研究中,经不同浓度的HD(浓度为0、30、60、90、120和180μg/m L)干预Hep G2细胞24 h和48 h后,HD对Hep G2细胞增殖的抑制作用不断增强,并呈剂量时间依赖关系。HD各试验组对Hep G2细胞的生长和增殖均表现出显著的抑制作用,差异具有统计学意义(P0.01);24 h的抑制率分别为5.26%、8.73%、11.00%、16.44%和27.72%;48 h的抑制率分别为1.80%、11.01%、19.38%、27.76%和42.01%。经HE染色和激光共聚焦检测,HD干预48 h后,Hep G2细胞呈煎蛋样改变,出现膜小泡和凋亡小体,核染色质分布不均匀,并且核膜破损,呈典型的细胞凋亡形态学改变。另外,通过Annexin V FITC双染观察,经HD处理48 h后,Hep G2细胞出现明显的细胞凋亡现象,进一步证明了HD能够诱导Hep G2细胞发生凋亡。当浓度为120和180μg/m L时,HD诱导Hep G2细胞的发生凋亡的百分比分别为12.10%和17.90%,显著高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。以上结果揭示HD可能是通过诱导Hep G2细胞凋亡而发挥其抗肝癌作用。5.在HD体外诱导Hep G2细胞凋亡机制的研究中,应用免疫荧光和Western blot技术,对Hep G2细胞中突变型P53、Bcl-2、Bax、Fas、Fasl、Caspase-3和Caspase-8的表达变化情况进行研究。与对照组比较,经HD处理的Hep G2细胞中突变型P53和Bcl-2蛋白的表达水平明显降低(P0.01),而Bax、Fas、Fasl、Caspase-3和Caspase-8蛋白的表达显著升高(P0.01),进一步表明HD诱导Hep G2凋亡作用可能与其激活细胞凋亡的线粒体途径和死亡受体途径密切相关。本研究通过动物模型体内试验和细胞培养体外试验两个途径,探讨了HD对H22荷瘤小鼠和Hep G2细胞的抗肿瘤作用及相关机制,通过药理学、病理学、生物化学和分子生物学等相关技术和方法,对与肿瘤发生和发展密切相关的细胞因子、m RNA、蛋白和细胞凋亡(细胞凋亡相关调控通路)等指标进行了系统的检测和分析,证实HD在体内和体外均具有明显的抑制肿瘤细胞生长和增殖的作用,这可能与HD能够激活细胞凋亡的线粒体途径和死亡受体途径密切相关,通过本研究可以为临床使用HD协助治疗肝癌提供理论和试验依据。
[Abstract]:The incidence of hepatocellular carcinoma ( HCC ) is second in all malignant tumors , secondary to lung cancer . The incidence of hepatocellular carcinoma is higher than that in developing countries . The incidence rate of HCC in China is higher than that in developing countries . In recent years , the incidence of hepatocellular carcinoma in China has been higher than that in the United States and Western European countries . Each group was randomly divided into 5 groups , i.e . control group , cyclophosphamide ( CTX ) positive control group , HD low - dose group ( 100mg / Kg ) , HD middle - dose group ( 200 mg / Kg ) and HD high - dose group ( 400 mg / Kg ) . The expression of Bcl - 2 , Bax , Fas , FasL , Caspase - 3 and Caspase - 8 in tumor tissues of mice bearing tumor bearing tumor was significantly decreased ( P0.01 ) . The results showed that HD could significantly improve the expression of Bcl - 2 , Bax , Fas , Fasl , Caspase - 3 and Caspase - 8 in tumor tissues of mice bearing tumor cells . 缁忎笉鍚屾祿搴︾殑HD(娴撳害涓，

本文编号：1959933