肝细胞肝癌进展相关长链非编码RNA筛选及功能研究

发布时间：2018-06-07 12:32

本文选题：肝细胞肝癌 + GEO　；参考：《第三军医大学》2017年博士论文

【摘要】：研究背景及意义:原发性肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)(以下简称肝癌)目前是世界范围内发病率排名第五,死亡率排名第三的恶性肿瘤,在我国也是较为常见的消化系统恶性肿瘤之一。中国肝癌新发病例及死亡病例几乎占全世界近50%,肝癌由于其初期发病隐匿,进展迅速,早期易转移,病死率较高,整体生存预后较差,目前肝癌的五年生存率仍较低,严重危害人类的健康。肝癌由于其器官特点,目前针对肝癌的诊疗原则主要是早期影像学诊断并通过外科行R0手术切除癌组织,但缺乏有效的早期诊断指标及术后复发转移仍是目前肝癌预后较差的主要原因,影响此过程的关键分子机制仍未完全明确。因此,寻找肝癌发生发展以及影响预后的肿瘤分子靶标及作用机制,对于提高肝癌早期诊断及术后患者长期生存率具有重要价值。近年来借助于高通量测序技术的迅猛发展而成本不断下降,国内外研究者利用基因芯片、全基因组测序及肿瘤代谢组学等高通量技术手段在肿瘤转录水平调控及转录后调控取得了较多成果。研究表明肿瘤基因组中95%以上比例的非编码蛋白的区域所转录的微小RNAs(mi RNAs)和长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lnc RNAs)等在肿瘤发生及演进中具重要调控作用,非编码RNA之间以及非编码RNA与蛋白编码RNA之间均存在着复杂的功能调控关系,这类作用在肝癌的发生发展中皆具有重要研究意义。肝癌相关研究表明lnc RNAs在肝癌细胞的增殖、凋亡和侵袭起重要作用,并与肝癌的发生、演进及预后密切相关;部分在肝癌细胞和组织特异性表达的lnc RNAs通过多种机制在转录水平及转录后水平影响肝癌细胞增殖、凋亡及细胞周期、侵袭转移、肿瘤细胞干性及肿瘤细胞转分化。尽管测序技术及芯片技术的提高及在肝癌研究中的普及,但各个研究团队筛选和关注的肝癌相关nc RNA(mi RNAs和lnc RNAs)不同,相似的研究发现并进入研究者视野的长链非编码RNA并不多且不尽相同,仍然有大量在肝癌中差异表达lnc RNA的功能调控分子机制仍旧不清楚。通过整合分析肝癌GEO芯片集筛选相关lnc RNA在肝癌发生及演进过程中的作用及其分子机制,将丰富我们对lnc RNA功能在肝癌的发生与进程的认识,同时也将为原发性肝癌的诊断、治疗及预后评估提供了新的理论依据和实验基础。研究方法:第一部分:基于GEO数据库的肝癌进展相关的信使RNA、微小RNA及长链非编码RNA的筛选鉴定1.定义检索策略后检索GEO数据库查找并下载肝癌相关数据集,建立纳入排除标准筛选GEO数据集,并利用R语言并进行差异分析,差异mRNA、mi RNAs和lnc RNAs的筛选标准是:P值0.05,|倍数差异|1.5。2.通过差异基因调控整合分析,并利用cytoscape软件构建mi RNAs-mRNAs调控网络,lnc RNAs-mRNAs共表达网络,lnc RNAs-mi RNAs调控网络,并通过靶基因及共表达基因对mi RNA及lnc RNA进行功能注释及KEGG通路分析。3.采用qRT-PCR检测技术在Hep G2细胞系中通过转染mi RNAs mimics验证mi RNA对lnc RNA调控作用,检测差异lnc RNAs在10例肝癌组织和癌旁组织中的表达水平,下载TCGA肝癌测序数据本地验证部分差异mi RNA和lnc RNA在肝癌组织和癌旁组织中表达水平及相关性。第二部分:长链非编码RNA LOC90784在肝癌发生及演进过程中的细胞生物学功能及分子生物学机制1.运用荧光原位杂交技术(FISH)检测长链非编码RNA LOC90784在Hep G2及SMMC7721肝癌细胞及肝癌组织新鲜样本中的表达及定位分布。2.利用qRT-PCR检测64例配对原发性肝癌组织和癌旁组织中长链非编码RNA LOC90784表达水平,比较长链非编码RNA LOC90784在原发性肝癌组织与癌旁组织中的表达差异。结合临床数据分析长链非编码RNA LOC90784与原发性肝癌患者临床病理分期分级,病理学分化程度,肿瘤微转移等临床特征关联性。3.为进一步明确长链非编码RNA-LOC90784与对肝癌细胞表型的影响,设计合成lnc RNA LOC90784的3条si RNA干扰序列,并在Hep G2及SMMC7721细胞中分别转染lnc RNA LOC90784-si RNA negative control(NC)和lnc RNA LOC90784-si RNA后,通过CCK-8增殖、克隆形成实验、Transwell侵袭转移实验以及流式分析细胞凋亡及周期进程明确lnc RNA LOC90784在肝癌发生及进展中的功能及机制。4.根据第一部分根据预测结果,在组织学及细胞学水平验证mi R-145及mi R-195对lnc RNA LOC90784的调控作用;进一步探索lnc RNA LOC90784在侵袭转移方面的作用机制;同时利用TCGA数据验证在lnc RNA LOC90784在肝癌R0患者术后预后评估价值。第三部分:长链非编码RNA-OTUD7AP1在肝癌演进过程中促进肝癌细胞增殖细胞学调控机制及临床样本特征分析1.采用荧光原位杂交技术(FISH)检测长链非编码RNA-OTUD7AP1在Hep G2及SMMC7721肝癌细胞及肝癌组织新鲜样本中的表达及定位分布。2.采用qRT-PCR检测52例配对原发性肝癌组织和癌旁组织中长链非编码RNA OTUD7AP1表达水平,比较长链非编码RNA OTUD7AP1在原发性肝癌组织与癌旁组织中的表达差异。结合临床数据分析长链非编码RNA OTUD7AP1与原发性肝癌患者临床病理分期分级,病理学分化程度,肿瘤微转移等临床特征的相关性分析。3.为进一步明确长链非编码RNA OTUD7AP1与对肝癌细胞表型的影响,设计合成长链非编码RNA OTUD7AP1的3条si RNA干扰序列,分组转染后采用CCK-8增殖、克隆形成实验及流式细胞凋亡及周期检测等实验评价不同组别肝癌癌细胞增殖、侵袭和转移以及调控细胞周期的能力。4.根据第一部分根据预测结果,在组织学及细胞学水平验证部分mi RNA和lnc RNA OTUD7AP1之间的调控作用;通过生物信息学序列分析进一步探索lnc RNA OTUD7AP1与亲本基因之间的调控,并在细胞学及组织学表达水平进行验证。研究结果:第一部分:肝癌进展过程中差异表达的mRNAs、mi RNAs及lnc RNAs获取,调控及共表达网络构建,关键mi RNA及lnc RNA表达及调控验证1.通过检索及进一步筛选获取9个GEO数据集,并通过整合数据集在mRNA芯片中共筛选了251个上调mRNA、377个下调mRNA;在mi RNA芯片中共筛选了2个上调mi RNA、13个下调mi RNA;在lnc RNA芯片中,共筛选了174个上调mRNA、78个下调mRNA,42个上调lnc RNA和7个下调lnc RNA(筛选标准:P0.05且|倍数改变|1.5)。2.表达网络构建及功能注释:通过筛选差异的mRNAs、mi RNAs及lnc RNAs,成功构建lnc RNAs-mi RNAs-mRNAs调控或共表达网络,并通过mi RNA靶基因及lnc RNA共表达基因进行功能注释及KEGG通路分析。3.经过筛选,10个高表达lnc RNA被筛选出并利用qRT-PCR检测进行表达水平验证,大多数lnc RNA显著高表达于肿瘤细胞系及肿瘤组织(P0.05);通过转染mi RNA mimics刺激并利用qRT-PCR检测lnc RNAs表达水平发现部分lnc RNA受mi RNA靶向调控,具有显著性统计学差异(P0.05),部分差异表达mi RNAs及lnc RNAs的表达水平及相关性通过TCGA样本测序数据明确验证(P0.05)。第二部分:肝癌组织中lnc RNA LOC90784水平与肝癌较差预后指标相关,下调肝癌细胞中LOC90784水平能显著抑制肝癌细胞增殖、侵袭转移及细胞存活。1.相较于癌旁正常组织及正常肝细胞系,qRT-PCR检测发现lnc RNA-LOC90784在肝癌组织及细胞系中显著性高表达,FISH检测其并主要定位分布于细胞质内。癌组织中表达水平并与肝癌组织分化(P0.001)、TNM中的T分期(P0.001)、血管有无侵犯(P=0.0237)、血清甲胎蛋白水平(P=0.0275)及HBV感染状态(P=0.0289)显著相关。2.CCK-8增殖检测及克隆形成实验及Transwell实验显示,相比较于si RNA NC组,lnc RNA-LOC90784 si RNA显著下调细胞中lnc RNA-LOC90784表达并显著抑制Hep G2及SMMC7721肝癌细胞的增殖,侵袭和转移,细胞凋亡及细胞周期阻滞(P0.05)。3.与第一部分预测结果一致,通过细胞学水平及组织学水平检测明确lnc RNA LOC90784表达受mi R-145和mi R-195抑制,下调lnc RNA LOC90784表达可抑制MMP2及MMP9 mRNA及蛋白水平进而抑制侵袭和迁移。4.肝癌组织中mi R-145与lnc RNA-LOC90784的表达水平存在负向相关(r=-0.6612,P=0.0015),同样在49例TCGA配对样本当中同样发现mi R-145与LOC90784表达水平的相关性存在负向相关(r=-0.4549,P0.001),对TCGA中261例肝癌R0术后患者进行生存分析发现,较高lnc RNA LOC90784表达水平与患者较差总体生存预后显著相关(P0.05)。第三部分:肝癌组织中lnc RNA-OTUD7AP1水平与肝癌较差预后指标相关,下调肝癌细胞中lnc RNA-OTUD7AP1水平能有效抑制肝癌细胞增殖,凋亡及阻滞细胞周期进程1.相较于癌旁正常组织及正常肝细胞系,qRT-PCR检测发现lnc RNA-OTUD7AP1在肝癌组织及细胞系中显著性高表达,FISH检测其并主要定位分布于细胞质内,肝癌中lnc RNA-OTUD7AP1表达水平与患者肝癌组织分化(P0.001)、TNM分期(P0.001)、血清AFP高低(P=0.0124)及肿瘤数目(P0.001)等临床特征显著相关.2.CCK-8增殖检测及克隆形成实验及流式细胞周期检测实验显示,相比较于si RNA NC组,lnc RNA-OTUD7AP1 si RNA能显著抑制肝癌细胞的增殖,诱导凋亡及细胞周期阻滞(P0.05)。3.与第一部分预测结果一致,通过细胞学水平发现lnc RNA OTUD7AP1受mi R-125b、mi R-101和mi R-130a抑制,组织中表达水平相关性分析发现mi R-125b与lnc RNA OTUD7AP1的表达水平存在负向相关(n=20,r=-0.4645,P=0.0168);OTUD7A mRNA在肝癌组织中低表达,下调lnc RNA OTUD7AP1表达能上调其亲本基因转录的OTUD7A mRNA在细胞学水平表达,两者在组织表达水平之间存在负相关(n=17,r=-0.4005,P=0.0283)。研究结论:第一部分:基于GEO数据库的肝癌进展相关的信使RNA、微小RNA及长链非编码RNA的筛选鉴定该部分研究通过整合分析有效提高GEO数据及利用率,并系统筛选鉴定了肝癌演进过程相关mRNAs、mi RNAs以及lnc RNAs;通过构建调控及共表达网络筛选肝癌潜在的具调控功能的nc RNAs;该发现有效丰富了我们对nc RNA在肝癌进展过程的理解,通过分析有效提供了深入研究肝癌发生发展的新的切入点,同时也为肝癌的早期诊断,预后评估提供了新思路和新的靶点。第二部分:长链非编码RNA LOC90784在肝癌演进过程中细胞生物学作用及机制研究该部分研究系统鉴定了lnc RNA LOC90784在肝癌中发挥肿瘤促进的细胞学功能机制及肝癌预后密切相关分子标记作用。lnc RNA LOC90784高表达于肝癌细胞及组织并受mi R-145和mi R-195负向调控,lnc RNA LOC90784通过促进肝癌细胞的增殖、侵袭、转移细胞存活及周期阻滞等细胞学行为在肿瘤的发生及演进中发挥作用,同时在肝癌患者预后中起着分子标记物的作用。该研究首次阐释lnc RNA LOC90784在肝癌增殖、侵袭及预后方面的作用。该发现将为肝癌的诊断治疗及预后评估提供新的思路和理论基础。第三部分:长链非编码RNA-OTUD7AP1在肝癌演进过程中促进肝癌细胞增殖细胞学调控机制及临床样本特征分析该部分研究系统鉴定了假基因转录本lnc RNA OTUD7AP1在肝癌中发挥肿瘤促进的细胞学功能机制及临床特征相关分析。肝癌细胞中lnc RNA OTUD7AP1表达受mi R-125b、mi R-101和mi R-130a抑制,并与mi R-125b在组织中表达呈负向相关;lnc RNA OTUD7AP1与亲本基因OTUD7A mRNA存在负向调控关系,下调lnc RNA OTUD7AP1表达抑制肝癌细胞的增殖、促进凋亡以及调控细胞周期等细胞学行为表明lnc RNA OTUD7AP1在肝癌进展中发挥重要的“促癌”作用。该部分研究发现将为假基因在肿瘤研究提供新研究思路和模式。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

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