肿瘤相关巨噬细胞与肿瘤细胞的交互作用促进肺腺癌上皮间质转化的机制研究

发布时间：2018-06-09 19:55

本文选题：肿瘤相关巨噬细胞 + FUT4LeY　；参考：《大连医科大学》2017年博士论文

【摘要】：一、背景非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是高发病率和死亡率的恶性肿瘤,约占肺癌所有病理类型的80~85%,以腺癌居多。尽管近年来NSCLC的诊断和治疗方面取得了一定的进展,但5年生存率仅13%左右。因此,深入研究NSCLC恶性演进的分子机制对于改善其疗效和预后至关重要。近年来大量研究表明肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)是决定肿瘤恶性生物学行为的关键因素。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)是指在肿瘤组织中浸润的巨噬细胞,是TME中数量最多的间质细胞群。多项研究表明TAMs参与了肿瘤的生长、侵袭和转移等多个过程,且其浸润数量与包括NSCLC在内的多种实体瘤的治疗耐药和不良预后密切相关。TAMs的促肿瘤作用与其呈巨噬细胞M2极化表型有关。然而,TAMs在肺腺癌中的确切作用仍不清楚。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞失去极性并获得间质细胞表型的过程,是肿瘤细胞获得侵袭和迁移能力的重要步骤。大量研究表明,EMT与包括NSCLC在内的多种实体瘤的侵袭、转移和不良预后密切相关。在口腔鳞癌、胰腺癌等肿瘤中的初步研究显示TAMs能够促进肿瘤细胞发生EMT,但其在肺腺癌中的作用仍不清楚。异常的糖基化是肿瘤的标志性特征之一。Lewis Y(Le Y)是一种双岩藻糖基化的寡糖,岩藻糖基转移酶4(Fucosyltransferase IV,FUT4)是Le Y合成的关键酶。FUT4/Le Y在包括肺癌在内的多种实体瘤中高表达,并与侵袭、转移及不良预后有关。然而,TAMs与FUT4/Le Y介导的岩藻糖基化的关系目前未见报道。泛素特异性肽酶22(ubiquitin-specific protease22,USP22)是一种新发现的去泛素化酶(deubiquitinase,DUB)家族成员,具有使组蛋白H2A、H2B去泛素化、组蛋白H4乙酰化的功能。USP22在多种实体瘤中高表达,并与肿瘤的发生发展、治疗耐药和不良预后密切相关。然而,TAMs与USP22介导的去泛素化的关系目前未见报道。本研究旨在探讨肺腺癌中FUT4/Le Y介导的岩藻糖基化在TAMs诱导的EMT中的作用,以及USP22介导的去泛素化在TAMs的趋化过程中的作用,有望为以TAMs为靶点的免疫治疗提供新的理论依据。二、方法1、收集2015年1月~2015年6月于大连医科大学附属第一医院胸外科切除并于病理科存档的肺腺癌石蜡组织标本60例。利用免疫组化方法检测CD68、E-cadherin、Le Y、USP22的表达。分析CD68、E-cadherin和Le Y表达的相关性,以及CD68和USP22表达的相关性。利用SPSS20.0软件进行统计分析,以P0.05为显著性标准。表达率的组间差异比较采用χ2检验。2、利用脂质体转染法将重组的FUT4干扰质粒转染至人肺腺癌细胞系A549和H1299细胞系中,通过G418筛选稳定转染FUT4干扰质粒的细胞克隆。构建Ezrin的野生型(wild-type,WT)过表达载体及T567D点突变过表达载体并转染。同样的方法在人肺腺癌细胞系H1299和H358细胞系中分别构建稳定干扰或过表达USP22的细胞系。3、ELISA方法检测巨噬细胞培养上清中TGF-β1的表达,以及肺腺癌细胞系培养上清中IL-1、IL-6、IL-8、CCL-2、CXCL1的表达。4、Western blot方法检测FUT4、Le Y、EMT标志蛋白、Ezrin、USP22、p65、H2B-ub1和IκB等蛋白的表达。5、间接免疫荧光方法检测β-catenin、F-actin及E-Cadherin的表达。6、免疫共沉淀方法检测Ezrin蛋白上Le Y糖蛋白的表达,以及UEA凝集素识别的岩藻糖基化水平。7、染色质免疫共沉淀方法检测H2B-Ubi与p65靶基因的结合、RNA聚合酶Ⅱ(丝氨酸-5磷酸化位点)与p65靶基因的结合以及p65与靶基因的结合。8、裸鼠成瘤实验证明肺腺癌中FUT4/Le Y对TAMs诱导的EMT的影响,以及USP22对TAMs浸润的影响。三、结果(一)肿瘤相关巨噬细胞通过FUT4/Le Y介导的Ezrin磷酸化促进肺腺癌上皮间质转化的机制研究1、人类肺腺癌组织中E-cadherin和Le Y的表达水平与TAMs的数量显著相关TAMs阴性组中E-cadherin的表达显著高于TAMs阳性组(P0.01),Le Y的表达则显著低于TAMs阳性组(P0.01)。TAMs的数量与E-cadherin的表达呈负相关(r=-0.505,P0.01),与Le Y的表达呈正相关(r=0.55,P0.01)。E-cadherin与Le Y的表达呈显著负相关(r=-0.798,P0.01)。2、M2型巨噬细胞通过TGF-β1/smad信号通路促进FUT4/Le Y的表达M2巨噬细胞条件培养基(TAM conditioned medium,TCM)中TGF-β1的表达水平与正常培养基相比显著上调,且呈浓度依赖性。TCM能够显著上调FUT4/Le Y的表达及Smad2/3的磷酸化,且呈浓度依赖性。LY36494和SB431542阻断TGF-β1/Smad信号通路后,TCM则无法上调FUT4/Le Y的表达。TGF-β1能够显著上调FUT4/Le Y的表达,且呈浓度依赖性。3、FUT4/Le Y在M2型巨噬细胞介导的细胞骨架重构及EMT中必不可少A549和H1299细胞系中干扰FUT4后Le Y的表达也显著下调。TCM处理后,A549和H1299细胞由鹅卵石样的上皮细胞形态转变为长梭形的间充质细胞形态,且间充质标志物N-cadherin、Vimentin和Fibronectin的表达显著上调。在上述两个细胞系中稳定干扰FUT4后,TCM则无法使细胞形态发生改变,同时间充质标志物的表达也显著低于仅用TCM处理组。联用外源性Le Y抗体和FUT4-sh RNA处理A549和H1299细胞后,间充质标志物的表达较单用外源性Le Y抗体或FUT4sh RNA处理下调更为明显。TCM诱导后,对照组A549细胞胞膜上E-cadherin显著下调,β-catenin由胞膜和胞浆移位至胞核,β-catenin的胞核表达显著上调。在A549细胞中稳定干扰FUT4后,E-cadherin的表达较单用TCM处理组显著上调,β-catenin则由核内重新定位至胞膜和胞浆,且其核内表达量较单用TCM处理组显著下调。TCM处理后,A549细胞中的F-actin大量聚合,并延伸出伪足,而对照组的细胞骨架为网状。在A549细胞中稳定干扰的表达后,TCM处理则不能使F-actin发生上述形态改变。4、FUT4/Le Y介导的Ezrin岩藻糖基化与Ezrin磷酸化密切相关TCM能够浓度依赖性地上调Ezrin蛋白T567位点磷酸化以及细胞标志物N-cadherin、Vimentin和Snail的表达。在A549和H1299细胞中稳定干扰FUT4后,TCM则无法上调上述蛋白的表达。在TCM处理的同时给予衣霉素预处理,结果发现Ezrin的N-糖基化受抑制后,TCM无法有效诱导Ezrin发生磷酸化,同时N-cadherin、Vimentin和Snail的表达也并未明显上调。生物信息学预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net NGlyc/)提示Ezrin蛋白拥有585个氨基酸,其23-26(NTTG)及247-250(NISF)的氨基酸序列是两个潜在的N-糖基化位点。免疫共沉淀方法证实Ezrin蛋白上存在Le Y糖蛋白的表达。应用UEA凝集素对Ezrin的岩藻糖基化水平进行检测,免疫共沉淀结果显示稳定干扰FUT4后Ezrin的岩藻糖基化水平显著下降。TCM处理条件下,过表达WT-Ezrin的载体能够回补干扰FUT4所导致的Ezrin T567D位点磷酸化水平下调和间充质标志物下调。过表达T567D-Ezrin则未出现上述改变。5、动物实验证实M2型巨噬细胞通过上调Le Y和p-Ezrin促进肺腺癌发生EMT将M2或M0型巨噬细胞与A549细胞1:4预混后进行裸鼠皮下种瘤。M2组于第6天成瘤,M0组直至11天成瘤。M2组的肿瘤体积显著高于M0组(P0.01)。M2组E-cadherin的表达显著低于M0组,同时伴有Vimentin的表达上调。此外,M2组中Le Y及p-Ezrin的表达显著高于M0组。(二)USP22调控NF-κB通路促进肺腺癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润的机制研究1、人类肺腺癌组织中USP22的表达与TAMs的浸润密切相关USP22阳性组中TAMs的阳性率为84.2%(32/38),而USP22阴性组TAMs的阳性率为18.2%(4/22),具有显著的统计学差异(P0.01)。USP22的表达水平与TAMs的浸润数量呈正相关(r=0.649,P0.01)。2、USP22能够促进肺腺癌细胞中NF-κB靶基因的转录选取USP22表达水平最高的H1299细胞系构建稳定干扰USP22的细胞系,选取USP22表达水平最低的H358细胞系构建稳定过表达USP22的细胞系。在10ng/ml TNF-α处理30min条件下,干扰USP22能够显著抑制H1299细胞培养基中IL-1、IL-6、IL-8、CCL-2、CXCL-1的表达,过表达USP22则显著上调H358细胞培养基中上述因子的表达;未经TNF-α处理组则未出现上述改变。在10ng/ml TNF-α处理30min条件下,干扰p65的表达能够显著抑制USP22过表达导致的上述因子表达上调。3、肺腺癌细胞中的USP22通过NF-κB通路促进巨噬细胞浸润在TNF-α处理条件下,干扰H1299细胞系中USP22的表达能够显著抑制巨噬细胞的侵袭,过表达H358细胞系中USP22的表达能够显著促进巨噬细胞的侵袭;而未经TNF-α处理组则未出现上述改变。利用p65-si RNA在稳定过表达USP22的H358细胞系中干扰p65的表达能够显著抑制USP22过表达对巨噬细胞浸润的促进作用。4、USP22通过去泛素化组蛋白H2B介导p65与其靶基因启动子的结合无论是否给予TNF-α处理,USP22干扰或过表达均无法影响IκB及p65的核定位。TNF-α处理条件下,干扰USP22的表达能够抑制H2B-Ubi与p65靶基因的结合、RNA聚合酶Ⅱ与p65靶基因的结合,以及p65与靶基因的结合。5、动物实验证实肺腺癌中的USP22能够促进TAMs的浸润将构建的稳定干扰USP22的USP22-sh1和sh-con H1299细胞接种至裸鼠皮下成瘤。USP22-sh1组的肿瘤体积(780±86 mm3)显著低于USP22 sh-con组(2200±231 mm3)(P0.01)。免疫组化显示USP-sh1组H2B-Ubi的表达显著高于USP22-sh-con组,USP-sh1组鼠巨噬细胞标志物F4/80的表达显著低于USP22 sh-con组。组织匀浆中USP-sh1组IL-1、IL-6、CCL-2、CXCL1的表达水平均显著低于USP22-sh-con组,而IL-8的表达并无差异。四、结论(一)肿瘤相关巨噬细胞通过FUT4/Le Y介导的Ezrin磷酸化促进肺腺癌上皮间质转化的机制研究1、人类肺腺癌组织中E-cadherin和Le Y的表达水平与TAMs的数量显著相关。2、M2型巨噬细胞通过TGF-β1/smad信号通路促进FUT4/Le Y的表达。3、FUT4/Le Y在M2型巨噬细胞介导的细胞骨架重构及EMT中必不可少。4、FUT4/Le Y介导的Ezrin岩藻糖基化与Ezrin磷酸化密切相关。5、动物实验证实M2型巨噬细胞通过上调Le Y和p-Ezrin促进肺腺癌发生EMT。(二)USP22调控NF-κB通路促进肺腺癌中肿瘤相关巨噬细胞浸润的机制研究1、人类肺腺癌组织中USP22的表达与TAMs的浸润密切相关。2、USP22能够促进肺腺癌细胞中NF-κB靶基因的转录。3、肺腺癌细胞中的USP22通过NF-κB通路促进巨噬细胞浸润。4、USP22通过去泛素化组蛋白H2B介导p65与其靶基因启动子的结合。5、动物实验证实肺腺癌中的USP22能够促进TAMs的浸润。
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【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

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