FKBP5基因突变在paget骨病发病中的作用及其机制研究

发布时间：2018-06-30 10:47

本文选题：Paget骨病 + 基因突变　；参考：《山东大学》2017年博士论文

【摘要】：Paget骨病(Paget'sdiseaseofbone,PDB)是一种慢性代谢性骨疾病,由异常的溶骨性病变继发过度的成骨性硬化而导致,常累及骨骼系统中的任意单个或者多个部位。PDB发病率具有显著地域差异,其在欧美一些西方国家发病率较高,是仅次于骨质疏松的第二大代谢性骨病。然而在非洲和亚洲国家PDB却较为罕见,其中我国自上世纪八十年代起已报道的PDB病例仅有约200余例。PDB临床症状常不典型,病情轻重不一。约22%的PDB患者无任何临床表现,仅仅在进行骨骼放射性检查时偶然检出患有Paget骨病。PDB常见的临床表现主要包括骨痛以及骨骼畸形,并可能伴随一系列的并发症,包括椎管狭窄、耳鸣、耳聋、视力下降等神经压迫症状、继发性骨关节炎以及骨折等,极少数患者会出现严重的并发症一骨肉瘤。破骨细胞异常活化是PDB主要的病理改变。病理检查可见患者受累骨骼处的破骨细胞数量增多,体积增大且含有较多胞核。PDB患者外周血单核细胞对破骨细胞诱导因子的敏感性增高,使得破骨细胞分化增多。PDB病理发展过程可大体分为三个时期:首先,破骨细胞异常活化导致溶骨增加,形成早期的溶骨期;第二,溶骨性病变继发成骨细胞活化,形成过度溶骨与成骨紊乱混合存在的混合期;最后,过度而无序的代偿性成骨增多形成骨硬化期。三期改变依次发生,最终导致患者骨骼结构紊乱、膨大畸形。PDB具体的发病原因至今仍不清楚,一般认为遗传因素和环境因素在PDB发病过程中均发挥重要作用。以往有研究认为,在PDB溶骨性病变部位的破骨细胞内存在麻疹病毒、呼吸道合胞病毒感染所形成的病毒小体,从而支持病毒感染导致PDB发病的结论。然而,关于这一类病毒小体的特异性仍存在较多争论,有研究者证实在遗传性草酸过多症和骨硬化症患者体内的破骨细胞中同样能检出这种病毒小体,同时许多研究者表示未能在PDB患者体内的破骨细胞中发现病毒感染的证据,提示病毒感染导致PDB发病的结论仍存有异议。遗传因素在PDB发病过程中具有重要的致病作用,迄今为止,通过全基因组关联分析以及候选位点关联分析,已经确认了 7个PDB易感基因位点(PDB1-7),提示PDB发病具有典型的遗传异质性。位于PDB3(5q35)的SQSTM1基因是目前唯一确认的PDB致病基因。流行病学研究表明约10-50%的家族性PDB患者以及5-30%散发性PDB患者存在SQSTM1基因突变。另外,TNFRSF11A、TNFRSF11B以及VCP基因,因其所编码的蛋白在破骨细胞分化发育中发挥重要作用,以及他们在一些PDB相关疾病中的致病作用,也被列为PDB候选致病基因而广泛关注。其中,位于TNFRSF11A基因的单核苷酸多态性(SNP):rs1805034与PDB易感性相关,但尚无证据能够证实该SNP是PDB的致病基因多态性。TNFRSF11B基因突变与早发性PDB(juvenile PDB)患者发病相关,VCP基因突变报道见于包涵体肌病伴Paget骨病和额颞叶痴呆,但在PDB患者中尚没有关于这两个基因突变的报道。本研究当中,我们报道了一个来自中国汉族人群的PDB家系,并对该家系中可能存在的PDB致病基因突变及其致病机制进行了深入的研究。课题从PDB致病基因检测、功能验证和机制研究三个方面,系统的证实了一个位于FKBP5基因的c.163GC突变是PDB的致病基因突变。通过本文的论述,我们旨在提高该罕见疾病在国内的认知度,减少PDB在国内的漏诊误诊率;探索该疾病的致病基因及其致病机制,为PDB病因学的研究提供数据支持以及新的研究方向。第一部分Paget骨病家系基因突变检测分析目的报道一例汉族家族性Paget骨病,并对该家系成员进行基因突变检测分析,寻找PDB相关基因突变。方法1.Paget骨病诊断根据患者典型的影像学检查结果、血清学检查结果及临床表现,诊断并报道一例家族性Paget骨病。2.PDB已知致病及相关基因测序分析对家系成员DNA样本进行已知PDB易感基因(SQSTM1、TNFRSF11A)外显子测序分析,寻找基因突变。3.外显子组测序分析对家系中三位PDB患者的DNA样本,以及患者的两位同胞兄妹的DNA样本,进行全外显子组测序分析(whole-exome sequencing,WES),并对WES分析得到的所有单核苷酸改变(Single Nucleotjde Variants,SNVs)按照下列条件筛选出与疾病共分离的基因突变:1.不存在于已知的单核苷酸多态性数据库(dbSNP)中;2.同时存在于三位患者的基因组内;3.不存在于两位正常对照成员的基因组内;4.位于基因编码区;5.引起基因编码错误。4.候选基因分析在Exome Aggregation Consortium(ExAC)数据库中查找,排除已知基因突变。通过运用PolyPhen-2软件预测突变功能,选取预测结果显示突变对蛋白功能有害的基因突变。综合以上分析结果,选择候选基因突变。5.FKBP5基因突变测序验证采用Sanger测序法,对所有家系成员以及200例正常对照的FKBP5第4外显子(FKBP5基因c.163GC突变所在位点)进行测序分析。从而验证该突变在家系中的分布情况以及验证该突变是否为未经报道的SNP。结果1.Paget骨病家系临床资料本研究报道了一例发生于中国汉族人群的典型的家族性Paget骨病。家系中现存3名Paget骨病患者。患者受累骨骼X射线检查结果符合典型的Paget骨病改变,包括骨皮质膨大增厚、骨小梁结构紊乱、受累颅骨呈现棉絮样改变等;病变累及部位主要包括:颅骨、椎骨及骨盆;患者临床表现主要包括骨痛、脊柱畸形、颈椎及四肢乏力、身高缩短及病理性髌骨骨折等;血清学检查结果显示患者碱性磷酸酶(ALP)活性显著升高。在疾病得到诊断(2011)到患者接受药物治疗(2014)的三年中,家系中三名患者病情及血清ALP水平随时间增加而进行性加重。2014年,患者接受密固达静脉注射治疗后病情得到有效控制。2.该PDB家系中未检测到SQSTM1及TNFRSF11A基因突变除多个SNP位点外,在患者及其他家系成员中,未检测到SQSTM1及TNFRSF11A基因突变。提示可能存在新的基因突变参与PDB发病。3.外显子测序分析结果显示一个新的FKBP5基因突变与PDB发病相关外显子组测序分析结果显示5个位于不同基因的错意单核苷酸突变,包括:FKBP5(c.163GC)、ACBD4(c.4GT)、MYO7B(c.772AT)、AKNA(c.4196AG)、CCL4L1(c.197GC)可能与PDB发病相关。其中位于ACBD4、MYO7B及CCL4L1的基因突变在ExAC数据库中已有报道,而位于FKBP5以及AKNA基因的突变在ExAC数据库中未见报道。PolyPhen-2预测结果显示FKBP5(c.163GC)基因突变极有可能损害蛋白功能(possible pathogenicity score:0.992),而AKNA(c.4196AG)基因突变极有可能为良性突变,不影响蛋白功能(possible pathogenicity score:0.080)。另外,FKBP5基因位于一个已知的PDB易感位点(PDB1)内,且根据以往文献的报道FKBK5编码的FKBP5蛋白在两条破骨细胞分化发育相关的信号通路:NF-κ B以及AKT信号通路中具有重要的调节作用。因此,确认该FKBP5基因突变可能与PDB发病相关,并选择该突变为PDB候选致病基因突变。4.FKBP5突变验证测序结果确认家系中所有患者的FKBP5基因均存在c.163GC点突变,表型为GC杂合子。家系中有5位患者的后代(Ⅲ3,Ⅲ13,Ⅲ15,Ⅲ17,Ⅳ2)携带有该基因突变。同时,在200例对照人群中未检出该基因突变,证实该基因变异是一个新发现的单核苷酸突变而非未经报道过的SNP。结论本研究报道了一例发生在中国汉族人群中的罕见家族性Paget's骨病。通过对家系成员进行基因检测分析,确认该家系中不存在已知的PDB易感基因突变。外显子组测序分析确认一个新的位于FKBKP5基因的c.163GC突变为PDB候选致病基因突变。第二部分FKBP5V55L对NF-κ B和Akt信号通路的影响目的预测突变体FKBP5V551三维结构,并通过细胞实验比较野生型和突变型FKBP5在NF-κ B以及Akt信号通路中的调节作用。方法1.FKBP5V55L突变体结构预测使用Pymol软件对FKBP5V55L突变体蛋白三维结构进行预测。2.NF-κB信号通路研究a.将构建有野生型及突变型FKBP cDNA的真核细胞表达质粒及空载对照质粒(pcDNA3.1-FKBP5(V55)、pcDNa3.1-FKBP5(L55)、pcDNA3.1)、PGL4.32[luc2p/NF-κ B-RE/Hygro]质粒以及 PRL-TK 质粒共转染到HEK293细胞内,通过检测各转染组细胞的荧光素酶活性(luciferase assay)反应 NF-κ B 的转录启动活性。b.将pcDNA3.1-FKBP5(V55)、pcDNA3.1-FKBP5(L55)、pcDNA3.1 质粒分别转染到 HEK293 细胞内,通过 western blotting检测各转染组细胞活化前后胞核与胞质蛋白中p65的量以及胞质蛋白中IκB的量,反应NF-κ B核转位水平。3.Akt磷酸化水平检测将pcDNA3.1-FKBP5(V55)、pcDNA3.1-FKBP5(L55)、pcDNA3.1质粒分别转染到HEK293细胞内,转染后的细胞经血清饥饿后用脂多糖(LPS)刺激活化。提取活化的细胞的总蛋白,经蛋白免疫印迹实验(western blotting)检测细胞内Akt Seer473位点磷酸化水平,研究野生型及突变型FKBP5对Akt磷酸化的调节作用有无差异。4.Akt激酶活性检测将构建有野生型和突变型FKBP5的慢病毒载体(LV-FKBP5(V55)/EGFP、LV-FKBP5(L55)/EGFP)分别转染到U937细胞内,建立表达野生型及突变型FKBP5的单克隆U937细胞系。将两组细胞分别接种到六孔板内,经过两小时血清饥饿后,加10%FBS活化细胞。提取两组细胞的总蛋白,使用Akt激酶活性检测试剂盒检测两组总蛋白中Akt激酶的活性。结果1.FKBP5V55L突变体结构蛋白质三级结构预测结果显示,V55L氨基酸改变位于FKBP5 N末端第一个β折叠内,FK1结构域的表面。亮氨酸疏水侧链较缬氨酸更为突出,可能使得突变所在位点的空间位阻增大,从而影响该结构域与底物的结合能力。2.V55L突变不影响FKBP5对NF-κB信号通路活化的调控作用荧光素酶活性实验证实野生型及突变型FKBP5转染组细胞之间,相对荧光素酶活性(relative luciferase activity)没有显著差异,p=0.3624。同时,western blotting结果显示野生组与突变组HEK293细胞活化后,其胞内IκB降解以及p65核转位水平均无明显差异。说明该V55L突变不影响FKBP5对NF-κ B信号活化的调控作用。3.FKBP5V55L突变增加AktSer473位点磷酸化水平突变型FKBP5过表达的HEK293细胞在经过活化后,其Akt Ser473位点磷酸化水平高于野生型FKBP5过表达的HEK293细胞的AktSer473磷酸水平;条带灰度值分析证实,突变组pAkt(Ser473)/Akt比例高于野生组,p=0.0075。证明该V55L突变影响FKBP5蛋白对Akt磷酸化的调节作用,与野生型FKBP5相比突变的FKBP5能够增加Akt磷酸化水平。4.FKBP5 V55L突变增加Akt激酶活性Akt激酶活性检测发现,与野生型FKBP5相比突变型FKBP5能够增加Akt激酶对GSK-3 a的磷酸化作用。证实该突变能够增加Akt激酶活性。结论FKBP5V55L突变不影响FKBP5蛋白对NF-κ B活化及核转位的调控作用。FKBP5V55L突变体蛋白能够增加Akt磷酸化水平,提高Akt激酶活性。第三部分FKBP5V55 C57BL/6小鼠破骨细胞活性及表型研究目的验证FKBP5V55L突变体蛋白对破骨细胞分化及破骨吸收活性的影响,并对其机制进行研究。探索FKBP5V55L点突变转基因小鼠paget骨病表型。方法1.FKBP5V55L及FKBP5WT小鼠繁育及鉴定本实验中V55L+-F1代杂合子转基因小鼠购自赛业生物科技有限公司。实验小鼠饲养严格按照《实验动物管理条例》、《山东省实施实验动物管理条例办法》的相关规定执行。小鼠饲养环境为SPF级,使用V55L'-杂合子小鼠作为亲代繁育子代同窝小鼠。子代小鼠鉴定:剪取小鼠尾尖组织,用50nM NaOH溶液裂解后作为DNA模板。使用PCR产物琼脂糖凝胶电泳以及sanger测序法验证子代小鼠基因型,并用于后续实验。2.破骨细胞分化分离培养FKBP5V55L小鼠及同窝FKBP5WT野生鼠骨髓来源的单核/巨噬细胞系细胞(bone marrow-derived monocyte/macrophage ccells,BMMs),经 M-CSF因子(30ng/ml)及不同浓度的 RANKL 因子(0、30ng/ml、70ng/ml、150ng/ml)诱导分化3天后,通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)鉴定并计数破骨细胞。鉴定方法:胞核≥3个,TRAP染色阳性的多核巨细胞为破骨细胞。3.陷窝吸收实验分离培养FKBP5V55L小鼠及同窝FKBP5WT野生鼠BMMs,并接种在牛骨切片上。经M-CSF(30ng/ml)、RANKL(100ng/ml)诱导分化7天后,超声裂解切片上的细胞并用1%甲苯胺蓝染色。在显微镜下拍照并计算每个视野中吸收陷窝的面积。4.实时定量PCR检测破骨细胞相关分子表达FKBP5V55L小鼠及同窝FKBP5WT野生鼠BMMs,经RANKL(100ng/ml)诱导0、1、2、3天后,提取总RNA并逆转录为cDNA,通过实时定量PCR检测破骨细胞相关分子NFATC1、TRAP及OSCAR表达水平。5.western blotting FKBP5V55L 小鼠及同窝 FKBP5WT 野生鼠 BMMs,经M-CSF(30ng/ml)、RANKL(100ng/ml)诱导 0、]、2、3 天后,提取总蛋白,经 western blotting检测NFATC1、c-fos及LC3表达。FKBP5V55L小鼠及同窝FKBP5WT野生鼠BMMs,经 M-CSF(30ng/ml)、RANKL(100ng/m;)诱导分化 3 天后,血清饥饿 4 小时。加RANKL因子活化细胞0、5、10、30分钟,立即提取细胞总蛋白。经western blot检测Akt磷酸化、Erk磷酸化以及IKB表达水平。6.小鼠股骨Micro-CT取10个月大FKBP5V55L小鼠及同窝FKBP5WT野生鼠股骨及胫骨并固定。固定后的标本使用西门子Inveon micro-CT检测仪扫描。扫描结果使用仪器自带Inveon Acquisition Workplace 和 Inveon Research Workplace 平台进行成像及骨吸收参数分析。结果1.FKBP5V55L及FKBP5WT小鼠繁育及鉴定本实验中V55L+-杂合子小鼠生育能力正常。经PCR琼脂糖凝胶电泳鉴定及sanger测序分析,证实子代小鼠中FKBP5V55L、FKBP5WT及杂合小鼠出生比例基本符合孟德尔遗传规律。选择同窝小鼠中的FKBP5V55L及FKBP5WT小鼠作为实验及对照小鼠用于后续研究。2.FKBP5V55L小鼠来源的祖细胞破骨细胞分化能力增强小鼠破骨细胞体外分化及TRAP染色结果显示,野生组与突变组小鼠BMMs在MCSF/RANKL诱导3天后,分别开始分化为破骨细胞,且形成的破骨细胞数目随RANKL浓度增高而增加。在相同浓度的RANKL因子诱导下(70ng/ml、150ng/ml),平均每个低倍视野下(40×)突变组小鼠BMMs形成的破骨细胞数目明显多于野生小鼠(70ng/ml:FKBP5WT VS FKBP5V55L:42.7±7.6 VS 72.2±13.2,p=0.0284;150ng/ml:FKBP5WT VS FKBP5V55L:55.7±22.1 VS 130.3±23.5,p=0.0162)。3.FKBP5V55L小鼠来源的破骨细胞骨吸收活性增高陷窝吸收实验结果显示每高倍视野下(100×)FKBP5V55L小鼠来源的破骨细胞形成的陷窝面积显著大于对照小鼠来源的破骨细胞(FKBP5 VS FKBP5V55L:4.73±1.02 mm2 VS 8.29±0.66 mm2;p=0.0071)。4.FKBP5V55L小鼠骨髓单核/巨噬细胞 NFATC1、TRAP及OSCAR表达高于野生小鼠实时定量PCR结果显示野生及突变小鼠BMMs在RANKL诱导下,转录因子NFATC;及破骨细胞相关分子TRAP、OSCAR表达量均显著增高。并且在RANKL诱导时间相同的条件下,FKBP5V55L小鼠BMMs的NFATC1、TRAP及OSCAR表达水平显著高于野生小鼠。同时,Western blotting结果显示FKBP5V55L小鼠BMMs的NFATC1转录因子表达水平高于野生小鼠,而两组细胞之间c-fos表达量无明显差异。5.FKBP5V55L鼠骨髓单核/巨噬细胞Akt磷酸化水平增高FKBP5V55L小鼠来源的BMMs经RANKL因子活化后,其胞内Akt磷酸化水平高于对照组小鼠BMMs的Akt磷酸化水平;同时,两组细胞之间Erk磷酸化及IκB降解水平无明显差异。说明FKBP5V55L可能通过调控Akt磷酸化水平影响破骨细胞分化及参与PDB发病。6.FKBP5V55L小鼠表现出部分PDB表型小鼠股骨近端Micro-CT骨参数分析结果显示,与野生小鼠相比FKBP5V55L鼠股骨:相对骨体积(Bone volum/Total volum,BV/TV)、骨小梁数量(Trabecular Number,Tb.N)、骨小梁厚度(Trabecu;ar Thinckness,Tb.Th)减少;而骨小梁分离度(Trabecular Spacing,Tb.Sp)、骨小梁模式因子(Trabecular Bone Pattern factor,TBPf)增加。FKBP5V55L小鼠呈现出明显的小梁骨过度吸收表现,与体外实验发现的破骨细胞分化及骨吸收能力增加相对应。然而,FKBP5V55L小鼠Mi cro-CT检测未见异常的骨皮质增厚及扩张表现。股骨远端及胫骨近端部位3D骨重建结果显示,三只FKBP5V55L小鼠中有两只小鼠的股骨远端骨皮质出现可疑的骨吸收陷窝,而三只FKBP5WT小鼠中未见该改变。提示FKBP5V55L鼠体内存在溶骨增加性病理改变,部分符合PDB表型。结论FKBP5V55L突变增加小鼠体外破骨细胞分化及骨吸收能力。FKBP5V55L突变主要通过增加Akt/NFATC1信号通路来调控破骨细胞分化能力。FKBP5V55L突变增加小鼠体内破骨细胞数量,能够导致小鼠骨骼出现PDB样溶骨性病理改变。提示本研究所报道的FKBP5 c.163GC基因突变(FKBP5V55L)能够通过增加破骨细胞分化及增加破骨细胞活性从而导致PDB发生。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R681

【参考文献】