E3泛素连接酶Nrdp1通过基质金属蛋白酶（MMP7）信号通路抑制大肠癌细胞侵袭

  研究背景及意义结直肠癌(colorectal carcinoma, CRC)是一种人类常见的恶性肿瘤,是在内、外因素影响下发生的多基因表达失调的一种个体化疾病,严重威胁着人类生命健康。从分子水平解释结直肠癌,有助于阐释这种高发肿瘤发生发展机制,为其早期诊断提供基因检测工具,为从分子水平的定向治疗提供前瞻标志物,其中一些高频突变和一些常见信号通路有可能成为治疗结直肠癌的靶点。蛋白质的泛素化修饰是人体内非常重要的一种翻译后的修饰方式,该修饰可以与被修饰蛋白的稳定性和功能活性状态有关。它可以有效调节细胞的凋亡和免疫炎症反应等病理生理过程。其中E3连接酶是泛素蛋白酶中种类最多的一种,目前认为泛素系统不仅仅是细胞中蛋白质的重要降解系统,它能通过调控底物蛋白质的活性,参与调节多种重要的生命过程的发生和发展,泛素系统的异常与机体的炎症性疾病、肿瘤等有很大的关系。神经调节素受体降解蛋白1(NrdP1)是近年来发现的一种泛素E3连接酶,它不仅能调节细胞凋亡和免疫炎症反应等病理生理过程,而且有研究显示NrdP1能抑制肿瘤细胞的生长和增殖。目前,在大肠癌中Nrdp1已经被证明能够通过下调p27表达来抑制肿瘤细胞的生长。然而,Nrdp1是否能够调节大肠癌细胞的侵袭能力至今尚未明确。本研究致力于Nrdp1在结直肠癌细胞侵袭中的作用及机理研究。体外研究中我们通过RT-PCR、Western blotting的方法研究了结肠癌细胞Caco-2细胞中Nrdp1和MMP7之间的关系,进一步通过siRNA敲除Nrdp1、MMP7在Caco-2细胞中的表达研究了Nrdp1在肿瘤侵袭中的作用并探讨具体作用机制。Western blotting方法检测结肠癌组织中Nrdp1及相关分子的表达并分析研究。最终,我们首次阐明了Nrdp1可能通过抑制EGFR下游信号通路中的ERK/MAPK通路来抑制MMP7在大肠癌细胞中的表达和在结肠癌细胞侵袭中的作用。本研究为更好的理解Nrdp1在肿瘤中的作用提供了新的理论依据。目的对大肠癌患者结肠癌组织(CR)和癌旁组织(NT)中Nrdp1及MMP7的表达情况进行检测,并对其相关性进行分析；探讨Nrdp1对MMP7的影响及其对结肠癌细胞侵袭能力的作用。方法收集20例组织标本(结直肠癌组织和配对的癌旁正常组织),所有的组织标本均来源于是山东大学附属济南市中心医院2008年～2014年间病理及临床诊断为结直肠癌的患者。Western Blotting方法检测20例大肠癌患者结肠癌组织(CR)和癌旁组织(NT)中Nrdp1及MMP7的表达情况；结直肠癌组织Nrdp1与MMP7表达进行相关性分析；在人结直肠癌细胞系Caco-2的基础上,通过脂质体介导的方法构建了过度表达Nrdp1 (Caco-2-nrdp1)的细胞系,转染空质粒的Caco-2细胞(Caco-2null)作为对照,同时采用Nrdp1siRNA转染caco-2细胞作为抑制Nrdp1表达(Caco-2-shndpl)的细胞系,分析不同Nrdp1表达水平人结直肠癌细胞系caco-2中MMP7的表达情况,同时采用Western Blotting方法进一步验证不同Nrdp1表达水平人结直肠癌细胞系caco-2中MMP7的表达情况；为了继续研究Nrdp1是否影响MMP7在结肠癌细胞侵袭中的作用,我们首先将MMP7siRNA和Ncontrol siRNA转染Caco-2细胞并分别命名为MMP7si-Caco-2和NCsi-Caco-2细胞,检测转染48 h后用Real Time PCR及Western blotting分别检测MMP7mRNA水平、蛋白水平的敲低效果；比较联合敲低Nrdp1/MMP7与单独敲低MMP7之后的MMP7表达水平；比较联合敲低Nrdp1/MMP7与单独敲低MMP7之后的细胞侵袭能力；比较不同Nrdp1表达水平人结直肠癌细胞系caco-2侵袭能力；对Nrdp1抑制MMP7在大肠癌细胞中的表达和在结肠癌细胞侵袭中的作用的信号通路进行筛选；比较联合敲低Nrdp1/MMP7与单独敲低MMP7之后的细胞增殖能力；比较联合敲低Nrdp1/MMP7与单独敲低MMP7之后的细胞凋亡比例。结果结直肠癌中Nrdp1的表达水平显著低于癌旁组织(P0.05), MMP7的表达水平显著高于癌旁组织(P0.05)；Nrdp1及MMP7的表达呈负相关相关(r=-0.82,P0.001)。Caco-2-nrdp1细胞中Nrdp1表达升高,Caco-2-shnrdp1细胞中Nrdp1表达显著下降(P0.05)。同时我们的研究发现,在Caco-2-nrdpl细胞中MMP7的表达水平显著下降,而caco-2-shnrdp1细胞中MMP7的水平显著升高(P0.05),同时Western Blotting也验证了这个结果。MMP7siRNA转染Caco-2细胞后,MMP7的表达被有效下调了。Caco-2细胞中敲低Nrdpl之后MMP7水平明显升高,联合敲低Nrdp1/ MMP7之后MMP7水平较单独敲低MMP7明显升高(P0.05)。Ncontrol siRNA和MMP7 siRNA作用Caco-2细胞后穿膜的平均细胞数分别为252.67±14.16个和56.00±5.00个,Nrdp1/MMP7 siRNA联合作用Caco-2细胞后穿膜的平均细胞数为156.00±10.00个,提示Caco-2细胞中敲低MMP7后细胞侵袭能力明显下降,联合敲低Nrdp1/MMP7后细胞侵袭能力较单独敲低MMP7明显上升,表明Nrdpl抑制了MMP7在结肠癌细胞侵袭中的作用。Caco-2-Nrdp1、Caco-2null、Caco-2-shNrdp1作用Caco-2细胞后穿膜的平均细胞数分别为89.60±12.10个、152.00±8.00个和589.00±12.00个；在Caco-2-shNrdp1细胞中抑制MMP7的表达, Caco-2-shNrdp1-shMMP7作用Caco-2细胞后穿膜的平均细胞数为126.40±4.35个,表明Caco-2-Nrdp1细胞的侵袭能力最弱,caco-2-shNrdp1细胞的侵袭能力最强；在Caco-2-shNrdp1细胞中抑制MMP7的表达,caco-2-shNrdp1的侵袭能力降低。PD98059没有影响Nrdp1的表达水平,但抑制了MMP7的表达水平(P0.05),导致了细胞侵袭力的显著下降(P0.05),提示Nrdp1可能通过抑制ERK / MAPK通路抑制MMP7的表达。Caco-2细胞中敲低MMP7后细胞增殖能力明显下降,联合敲低Nrdp1/MMP7之后细胞增殖能力较单独敲低MMP7明显降低。Ncsi-Caco-2细胞、MMP7si-Caco-2细胞和Nrdp1/MMP7si-Caco-2调亡比例分别为0.8%、1.6%和1.9%,由于对照组细胞的调亡比例很低,我们分析Caco-2细胞处在增殖期,不在调亡期,因此敲低MMP7与联合敲低Nrdp1/MMP7可能不影响细胞的调亡。结论1.在结直肠癌组织中Nrdp1的表达下降,MMP7的表达升高,两者呈负相关；2.结肠癌细胞Caco-2中联合敲除Nrdp1/MMP7之后细胞侵袭能力较单独敲低MMP7明显升高；繁殖能力降低；而对细胞凋亡的影响不大；Caco-2-nrdp1细胞的侵袭能力最弱,Caco-2-shnrdp1细胞的侵袭能力最强,同时在Caco-2-shnrdp1细胞中抑制MMP7的表达,Caco-2-shnrdp1的侵袭能力降低,说明Nrdp1抑制MMP7在结肠癌细胞侵袭中的作用；3. Nrdp1可能通过抑制EGFR下游信号通路中的ERK/MAPK通路来抑制MMP7在大肠癌细胞中的表达。综上所述,本研究证实了Nrdp1/MMP7新通路可以抑制结肠癌细胞的侵袭能力,表明Nrdp1在肿瘤细胞中有多种功能,因此本研究丰富了Nrdp1通过泛素化某些蛋白调控某些细胞功能,为肿瘤分子生物学研究提供了新的方向。

【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34
【目录】：

【参考文献】

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