电针“内关”穴改善自发性高血压大鼠心肌肥厚效应及其机制研究

发布时间：2018-08-18 20:49

【摘要】：众所周知,高血压是导致各种心血管疾病发生的最为关键的危害因素之一,长期高血压可以引起心脏结构的异常及高血压性心肌舒缩功能的损害。其中,最常见的病症为高血压性心肌肥厚,主要表现为心肌细胞代偿性肥大,心脏间质成纤维细胞增殖以细胞外基质大量积聚,最终可导致心律失常、心肌梗死、心力衰竭和心源性猝死。相关研究揭示,高血压-心肌肥大-心肌纤维化病理进程的发生除了与持续高血压引起的心肌压力和容量超负荷有关外,多种神经体液因素也在该病的形成过程中扮演重要角色,主要包括交感神经长期过度兴奋和β 1-肾上腺受体(β 1-AR)活性的异常增加,肾素-血管紧张素系统(RAS)活动的异常和相关细胞因子及生长因子的活化,如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转化生长因子-β 1(TGF-β1)及基质外金属蛋白酶系统(MMPs)等。近年来,逆转左心室肥厚、心肌纤维化及左心室舒缩功能损害被认为是治疗慢性高血压的关键环节,并成为医学界研究热点。目前,尽管临床上用于控制血压、逆转心肌肥大和心功能损害的许多新颖的药物不断的涌现,但仅有少数高血压患者的症状能够得到较理想的控制,究其原因主要是这些药物的低兼容性,且靶点较为单一,并伴有诸多毒副作用。相关研究证实,针刺某些穴位具有直接的降压效应,其可通过躯体-自主神经反射影响脑干交感中枢核团的传出活动,或经兴奋迷走神经的功能活动来对抗慢性高血压状态下交感神经的过度紧张性活动及过度激活的β1-AR。除神经机制外,针刺还可以通过调节上述参与高血压病理进程的内分泌网络,包括RAS、炎症因子和酶类等,从而改善慢性高血压及诱发症状。此外,针刺内关穴可通过调节心肌细胞内Ca2+浓度及与钙信号相关蛋白有效地改善心功能,适用于心律不齐、心绞痛、心功能不全等多种心血管疾病的治疗。因此,进一步探索和揭示针刺对高血压-心肌肥厚-心功能损害的作用效果具有一定的科学价值和潜在的临床应用前景。1实验目的本研究以12周龄自发性高血压大鼠(SHR)作为研究对象,以同周龄Wistar Kyoto(WKY)作为对照组,采用无创血压记录和超声心动图技术,观察连续8周电针“内关”穴对SHR模型大鼠血压和心脏结构、功能动态变化的影响;在确定电针有效改善高血压-心肌肥厚/纤维化-心功能损害病理进程的基础上,通过免疫组织化学染色、Western Blotting、Real-Time PCR和放射免疫等方法,揭示电针“内关”穴发挥该效应的分子生物学机制,旨在为高血压-心肌肥厚/纤维化-心功能损害的临床治疗提供新的途径。2实验方法本研究实验分两阶段进行。第一部分主要观察电针内关穴抑制SHR左心室肥厚及舒缩功能损害的疗效:实验选用SPF级健康雄性12周龄WKY 10只作为正常组,另选同周龄自SHR30只,分为SHR、SHR+EA、SHR+Sham组,每组大鼠各10只。其中,SHR+EA组选取双侧“内关”穴干预(2/15Hz,1mA,持续30min),每日1次,共8周。假电针组仅于内关穴浅刺,不给予电刺激。于电针前和每周电针后采用无创血压仪测量各组大鼠清醒状态下下尾动脉收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和平均动脉压(MAP);采用高分辨率超声心动图影像系统分别于电针干预前及电针干预第2,4,6,8周后进行超声心动图检查,观察各组大鼠心肌肥厚指标的差异。于电针干预结束后称量左心室湿重,并计算心重体重比(HMI),左心室心肌质量指数(LVMI)。采用HE染色法、VG染色法,免疫荧光组织化学染色技术和Western Blotting等分析法观察心肌组织病理组织学改变及心肌组织中collagen Ⅰ、collagen Ⅲ表达量的变化。第二部分主要是对电针内关穴延滞SHR心肌肥厚的机制探讨:实验选SPF级健康雄性12周龄SHR18只,分为三组,即SHR、SHR+EA、SHR+Sham组,每组大鼠各6只。同周龄的WKY作为正常血压对照组,给予电针干预,干预方法及参数同上。于电针干预结束后,采用放射免疫法,酶联免疫吸附试验(Elisa法)和Real-Time PCR测定检测大鼠心肌组织或血清中ACE含量及TNF-α的表达。采用免疫印迹法(Western Blotting)观察比较心肌组织AT1R、AT2R、β1-AR、TGF-β 1、CTGF、MMP-2、MMP-9蛋白表达变化。采用Real-Time PCR法观察TGF-β1、CTGF、MMP-2、MMP-9mRNA相对表达量的变化。通过系统分析电针内关穴是否通过影响上述重要靶点从而达到改善高血压心肌肥厚的效应,以探讨哪些因素可能参与了电针内关穴改善高血压-心肌肥厚的相关机制。3实验结果3.1电针缓解SHR左心室肥厚及心功能损害的疗效观察3.1.1电针内关穴对SHR血压的影响各组大鼠动态无创血压记录结果显示,与自身的基础值比较,从电针干预5周后,SHR+EA组DBP和MAP显著降低(P0.05)。从电针干预6周后,SHR+EA组SBP显著降低(P0.05);而SHR组大鼠SBP、DBP和MAP均显著升高(P均0.05)。与WKY组比较,SHR组和SHR+Sham组的SBP、DBP和MAP均显著升高(P均0.05),并随周龄增加持续上升。与SHR组比较,从电针内关干预5周后,SHR+EA组SBP、DBP和MAP均显著降低(P均0.05),但假电针组MAP、SBP、DBP未见显著变化,始终与模型组数值接近,均保持在较高水平(P0.05),提示电针内关穴能够显著降低SHR高血压症状。3.1.2电针内关穴对SHR大鼠心重体重比和左心室重量指数的影响与WKY组相比,SHR组的心重/体重比(HW/BW),左室重量指数(LVWI)显著升高(P0.001),提示SHR出现心肌肥厚的表现。电针内关穴可以显著地抑制SHR组HW/BW和LVWI的升高幅度(P0.001,P0.01),这表明电针内关穴可有效改善SHR心肌肥厚症状。3.1.3电针内关穴对SHR心肌组织形态学改变的影响光镜下观察HE染色心肌切片可见:与WKY组比较,SHR组左心室腔明最缩小,心肌明显增厚,SHR+EA组可明显改善SHR组左心腔缩小和肌增厚的现象。而与SHR组比较,SHR+Sham组,没有明显变化。与WKY组比较,SHR组心肌细胞肿胀并且伴有炎性细胞浸润。电针干预八周后,心肌细胞体积不同程度减小,炎性细胞浸润现象减轻。与WKY组比较,SHR组的心肌细胞直径和横截面积显著增大(P0.05,P0.001),与SHR组比较,SHR+EA组的心肌细胞直径和横截面积均减小(P0.05,P0.001),而SHR+Sham组没有统计学差异(P0.05)。以上结果表明电针内关穴可有效改善高血压心肌肥厚状态下心脏结构和局部组织形态学的病理改变。3.1.4电针内关穴对SHR心功能各项指标的影响WKY 组随周龄的增加,其 LVAWd、LVPWd、LVIDd、LVEF、LVFS 指标没有显著变化。与WKY组相比,SHR组LVAWd、LVPWd显著升高(P0.05,P0.01,P0.001),而 LVEF、LVFS、LVIDd 显著降低,提示 SHR 出现心肌肥厚表现。与SHR组比较,电针内关穴6周后,SHR+EA组LVAWd显著降低(P0.01),LVEF、LVFS、LVIDd显著升高(P0.05,P0.001,P0.001);电针8周后,LVPWd亦显著降低(P0.05),SHR+Sham组上述各指标表现与SHR组一致,两组之间无统计学差异。以上结果提示电针内关穴可有效缓解SHR心肌肥厚症状。WKY随周龄的增加E/A比值没有变化。与WKY组相比,SHR组的E/A比值显著降低(P0.001),提示SHR出现了心肌舒缩功能的损害。与SHR组比较,电针内关穴6周,SHR+EA组E/A比值显著升高(P0.05,P0.01,P0.001);SHR+Sham组E/A变化与SHR组一致,且两组间无统计学差异。这表明电针内关穴可有效改善SHR心肌舒缩功能。3.1.5电针内关穴对SHR心肌组织胶原分布及羟脯胺酸含量的影响与WKY组比较,SHR组心肌纤维变粗,肿胀、间隙不清、断裂、融合或排列紊乱,心肌细胞明显肥大、浊肿,空泡样变化;细胞红色染色较多,提示胶原纤维增生明显。与SHR组比较,SHR+EA组上述心肌组织的病理损伤明显减轻,红色范围逐渐减少,提示心肌纤维化程度逐渐减轻;而SHR+Sham组病理损伤减轻不明显。与WKY组相比,SHR组心肌间质胶原面积(CA),心肌肌原容积分数(CVF)、羟脯胺酸(Hyp)的含量显著增高(P0.01,P0.001)。电针内关穴可以显著地抑制SHR组CA、CVF和Hyp的升高幅度(P0.05,P0.01),提示电针内关穴可有效抑制SHR心肌纤维化表现。与SHR组比较,SHR+Sham组上述三个指标无显著变化。以上结果表明电针内关穴可有效改善SHR心肌纤维化。3.1.6电针内关穴对SHR心肌组织Ⅰ型Col Ⅰ、Col Ⅲ表达的影响依据免疫染色结果,与WKY组相比,SHR组心肌间质Col Ⅰ、Col Ⅲ荧光共表达显著增加,说明心肌间质胶原沉积现象明显。与SHR组比较,SHR+EA组心肌间质Col Ⅰ、Col Ⅲ荧光共表达明显减少,SHR+Sham组Col Ⅰ表达亦有一定程度的降低、而Col Ⅲ荧光共表达变化不明显。定量分析结果统计显示:与WKY组相比,SHR组心肌组织Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白表达显著升高(P0.001);与SHR组比较,SHR+EA组心肌组织Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白表达显著下降(P0.001),此外,SHR+Sham组心肌组织ColⅠ、Col Ⅲ蛋白表达也出现一定程度的降低,但没有统计学差异。以上结果表明,电针内关穴可通过下调ColⅠ、Col Ⅲ蛋白表达从而缓解SHR心肌纤维化。3.2电针抑制高血压-心肌肥厚机制探讨3.2.1电针内关穴对SHR心肌组织β1-AR蛋白表达的影响与WKY组相比,SHR组心肌组织β1-AR蛋白表达显著升高(P0.01)。与SHR组比较,SHR+EA组心肌细胞β1-AR蛋白表达显著下降(P0.001),提示电针内关穴可能通过降低心肌细胞β1-AR表达,从而改善SHR心肌肥厚发展进程。这表明β1-AR可能是介导电针抑制高血压心肌肥厚的机制之一。3.2.2电针内关穴对SHR体内ACE含量及心肌组织AT1R、AT2R蛋白表达的影响与WKY组相比,SHR组血清和心肌组织中ACE的含量显著升高(P0.001)。电针干预可明显抑制SHR血清和心肌组织中ACE含量的异常升高(P0.001);SHR+Sham组上述ACE含量与SHR组无显著差异。与WKY组相比,SHR组心肌细胞AT1R蛋白表达显著升高(P0.001),而AT2R蛋白表达显著降低(P0.001)。与SHR组比较,SHR+EA组心肌细胞AT1R蛋白表达显著下降(P0.001),AT2R蛋白表达显著升高(P0.01),提示AT1R、AT2R蛋白可能是电针内关穴改善SHR心肌肥厚发展进程的分子途径之一。该部分结果提示对血管紧张素系统(ACE、AT1R、AT2R)的调节作用可能介导了电针抑制高血压心肌肥厚的作用。3.2.3电针内关穴对SHR血清TNF-α含量及心肌组织TNF-α mRNA表达的影响与WKY组相比,SHR血清中TNF-α含量及心肌组织TNF-α mRNA表达显著升高(P0.001)。与SHR组比较,SHR+EA组血清中TNF-α含量及心肌组织TNF-α mRNA表达显著下降(P0.001)。这表明TNF-α与高血压心肌肥厚密切相关,调节血清和心肌组织中TNF-α含量及表达可能是介导电针抑制高血压心肌肥厚的机制之一。3.2.4电针内关穴对SHR心肌组织TGF-β1、CTGF表达的影响与WKY组相比,SHR组心肌间质TGF-β 1和CTGF的荧光强度,蛋白及mRNA相对表达量显著升高(P0.001)。与SHR组比较,SHR+EA组心肌组织TGF-β 1和CTGF的荧光强度,蛋白及mRNA相对表达量显著下降(P0.01,P0.001)。提示电针内关穴对SHR组TGF-β,和CTGF异常表达的下调作用可能介导了电针缓解高血压心肌肥厚的作用。3.2.5电针内关穴对SHR心肌组织MMP-2、MMP-9 mRNA及其蛋白表达的影响各组间MMP-2 mRNA及其蛋白表达无显著差异。提示由于各组之间的MMP-2 mRNA及其蛋白表达没有明显的区别,因此,不能肯定MMP-2参与了介导电针抑制高血压心肌肥厚的作用。与WKY组相比,SHR组心肌组织MMP-9 mRNA及其蛋白表达明显降低(P0.001)。与SHR组比较,SHR+EA组心肌组织MMP-9蛋白表达及mRNA相对表达量显著升高(P0.05),但SHR+Sham组MMP-9蛋白表达及mRNA相对表达量未见显著变化。提示MMP-9可能介导了电针抑制心肌纤维化的进程。4结论SHR除表现为血压升高外,其左心室壁厚度、HW/BW、LVWI显著增加,射血功能明显减弱,CVF及Hyp、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ的表达异常增高,说明出现心肌肥厚为主要特征的心肌重塑,并伴有心功能受损。电针内关穴可以显著地抑制SHR血压的升高,改善心室厚度、LVEF等心功能指标,抑制HW/BW、LVWI等的异常增加,此外,电针内关穴一定程度上改善了 SHR心肌组织形态,减少了SHR心肌细胞直径和横截面积和CVF的过度增加,抑制了SHR心肌组织Hyp、collagen Ⅰ和collagenⅢ的异常表达,提示电针改善SHR高血压心肌肥厚发展进程疗效明确。电针内关穴在改善高血压-心肌肥厚的同时,可以明显抑制SHR血清或心肌组织中 ACE、β1-AR、AT1R、TNF-α、TGF-β 1、CTGF、MMP-9 的异常农达,提示血管紧张素系统、β 1-AR及上述相关细胞因子、生长因子和酶类可能参与了电针抑制SHR模型高血压-心肌肥大/纤维化的作用机制。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R245

【参考文献】