脂肪间充质干细胞来源的外泌体对血管基质成分造血功能的作用及机制研究

发布时间：2018-08-29 14:23

【摘要】：血管基质成分(SVF)是从脂肪组组中分离出来的细胞群,目前已广泛应用于组织再生领域。SVF中含有造血干/祖细胞,但数量少并且归巢能力低。在目前造血干细胞供者来源困难的情况下,如何对SVF中的造血干/祖细胞进行有效扩增,提高其归巢能力,是亟需解决的重要问题。脂肪间充质干细胞(adipose derived stromal cells,ADSCs)是一种多能干细胞,可促进移植后的造血重建。然而ADSCs的安全性限制了其在临床的广泛应用。脂肪间充质干细胞来源的外泌体(exosomes)是ADSCs释放到细胞外基质的膜性囊泡。exosomes介导的旁分泌机制在ADSCs为基础的治疗中发挥作用。因此本课题拟探讨ADSC-exsomes对SVF中造血细胞增殖和归巢的作用,为SVF的临床应用提供理论依据,同时为造血功能损伤修复治疗提供新的思路。方法:1.I型胶原酶摇床消化人脂肪组织,分离获取SVF,免疫磁珠分选SVF-CD34+细胞。通过流式细胞表型分析、造血干细胞集落培养、脾集落证实S VF-CD34+细胞的造血功能。2.贴壁培养法分离纯化ADSCs,鉴定其表型和功能型鉴定。运用超滤法和密度梯度离心法从第3代ADSCs中分离ADSCs-exosomes。通过透射电镜形态学、纳米颗粒可视性分析系统、Western Blot检测exosomes表面标志性蛋白对ADSC-exosomes 进行鉴定。3.ADSC-exosomes与SVF-CD34+细胞共培养,不同时间点检测细胞总数、CD34+细胞比例、细胞周期及造血干细胞集落,探讨ADSCs-exosomes对细胞增殖的影响。SVF-CD34+细胞用CM-DIL标记,与ADSC-exosomes共同植入TBI的NOD/SCID小鼠,荧光显微镜下观察SVF-CD34+细胞在骨髓腔和外周器官的定位,流式细胞检测骨髓腔内荧光标记细胞数,荧光定量PCR检测移植前后骨髓单个核细胞中CXCR4mRNA表达水平,探讨ADSCs-exosomes对SVF-CD34+细胞归巢的作用。4.ADSC-exosomes与SVF-CD34+共同植入,通过生存分析、血常规监测、骨髓常规、GVHD评估、流式细胞hCD45比例等指标探讨ADSC-exosomes是否有助于SVF-CD34+细胞的造血重建。研究结果:1.人脂肪组织中分离的SVF-CD34+细胞具有造血干/祖细胞的免疫表型和功能型。2.超滤法结合密度梯度离心法成功分离ADSC-exosomes。透射电子显微镜显示ADSC-exosmes是一群圆形或椭圆形膜性小囊泡,有完整胞膜,直径分布在76nm左右,exosomes相关蛋白CD63、CD9、CD81呈阳性表达,这些结果均符合exosomes的特性。3.ADSC-exosomes 与 SVF-CD34+共培养后,ADSC-exosomes 对 SVF-CD34+细胞的增殖呈浓度依赖性,随浓度增加增殖作用增强。共培养7天仍有足够的细胞处于分裂前期,有助于维持其干细胞特性。ADSC-exosomes能增加SVF-CD34+细胞CXCR4mRNA表达水平。体内实验证实ADSC-exosomes共移植可以使更多的SVF-CD34+细胞有效归巢至骨髓腔。实时定量PCR结果显示SDF-1、CXCR4基因转录水平较移植前升高。4.ADSC-exosomes与SVF-CD34+细胞共移植的NOD/SCID小鼠,血常规恢复时间较单独移植SVF-CD34+细胞组缩短,骨髓和脾脏中有更高比例的人源细胞植入。结论:1.本研究成功建立了从人脂肪组织中分离获取SVF-CD34+细胞的方法,并证实SVF-CD34+细胞的造血潜能。2.利用超滤法结合蔗糖密度梯度离心法可以从ADSCs细胞培养上清中可以获得高纯度的外泌体样本。3.ADSC-exosomes支持SVF-CD34+细胞的体外增殖,提高SVF-CD34+细胞的CXCR4 mRNA表达水平。4.体内实验证实了 ADSC-exosomes有助于SVF-CD34+细胞的有效归巢及移植后的造血重建,相关机制可能与调节SDF-1/CXCR4信号通路相关。这将为SVF在造血干细胞移植领域的临床应用提供实验依据,同时也为SVF-CD34+细胞体外有效扩增提供了新的途径和解决方法。
[Abstract]:Vascular matrix composition (SVF) is a group of cells isolated from adipose tissue and has been widely used in tissue regeneration. SVF contains hematopoietic stem/progenitor cells, but the number of them is small and the homing ability is low. Adipose-derived stromal cells (ADSCs) are a kind of pluripotent stem cells, which can promote hematopoietic reconstitution after transplantation. However, the safety of ADSCs limits its wide clinical application. Adipose-derived exosomes (exosomes) are the release of ADSCs into cells. Membranous vesicles of external matrix.Exosomes-mediated paracrine mechanism plays a role in ADSCs-based therapy.Therefore, this study is to explore the role of ADSC-exsomes in the proliferation and homing of hematopoietic cells in SVF, providing theoretical basis for the clinical application of SVF, and providing new ideas for the repair and treatment of hematopoietic function damage. Human adipose tissue was digested by enzyme shaking table, and SVF-CD34+ cells were isolated by immunomagnetic beads. The hematopoietic function of SVF-CD34+ cells was confirmed by flow cytometry, hematopoietic stem cell colony culture and spleen colony culture. 2. ADSCs were isolated and purified by adherent culture, and their phenotypes and functional types were identified by ultrafiltration and density gradient centrifugation. ADSCs-exosomes were isolated from ADSCs of the third generation. The surface marker proteins of exosomes were identified by transmission electron microscopy, nanoparticle visibility analysis system and Western Blot assay. SVF-CD34 + cells were labeled with CM-DIL and co-implanted with ADSC-exosomes into TBI NOD/SCID mice. The localization of SVF-CD34 + cells in bone marrow cavity and peripheral organs was observed under fluorescence microscope. The number of fluorescent labeled cells in bone marrow cavity was detected by flow cytometry. The number of bone marrow cavity was detected by fluorescence quantitative PCR before and after transplantation. The expression of CXCR4 mRNA in pulp mononuclear cells and the effect of ADSCs-exosomes on the homing of SVF-CD34+ cells were investigated. Results: 1. SVF-CD34 + cells isolated from human adipose tissue had immunophenotype and functional type of hematopoietic stem/progenitor cells. 2. ADSC-exosomes were successfully isolated by ultrafiltration combined with density gradient centrifugation. Transmission electron microscopy showed that ADSC-exosomes were a group of round or oval membranous vesicles with intact membranes, about 76 nm in diameter, and exosomes were isolated by ultrafiltration. The expression of CD63, CD9 and CD81 was positive. These results were consistent with the characteristics of exosomes. 3. ADSC-exosomes and SVF-CD34 + co-cultured, ADSC-exosomes on the proliferation of SVF-CD34 + cells was concentration-dependent, with the increase of the concentration of proliferation increased. After co-culture for 7 days, there were still enough cells in the pre-division stage to help maintain their stem cells. Characteristics. ADSC-exosomes can increase the expression of CXCR4 mRNA in SVF-CD34+ cells. In vivo experiments confirmed that co-transplantation of ADSC-exosomes can effectively homing more SVF-CD34+ cells into the bone marrow cavity. Real-time quantitative PCR results showed that the transcription levels of SDF-1 and CXCR4 genes were higher than those before transplantation. 4. ADSC-exosomes co-transplanted with SVF-CD34+ cells in NOD/SCID mice. The recovery time of blood routine test was shorter than that of SVF-CD34 + cell transplantation alone, and a higher proportion of human cells were implanted into bone marrow and spleen. Conclusion: 1. A method for isolation and isolation of SVF-CD34 + cells from human adipose tissue was successfully established and the hematopoietic potential of SVF-CD34 + cells was confirmed. 2. Ultrafiltration combined with sucrose density gradient centrifugation was used. High-purity exosomes can be obtained from the supernatant of ADSCs cells. 3. ADSC-exosomes support the proliferation of SVF-CD34 + cells in vitro, and enhance the expression of CXCR4 mRNA in SVF-CD34 + cells. 4. In vivo experiments have confirmed that ADSC-exosomes contribute to the effective homing of SVF-CD34 + cells and hematopoietic reconstruction after transplantation. The mechanism may be related to This will provide experimental basis for the clinical application of SVF in the field of hematopoietic stem cell transplantation, and also provide a new way and solution for the effective expansion of SVF-CD34+ cells in vitro.
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R457.7

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 仵敏娟,刘善荣,刘厚奇;间充质干细胞特性与应用前景[J];生命科学;2004年03期

2 本刊编辑部;;我国首家间充质干细胞库在天津落成[J];中国药业;2006年07期

3 张鑫;赵桂秋;;间充质干细胞在眼科领域的研究与应用[J];中国组织工程研究与临床康复;2009年06期

4 史春梦;;间充质干细胞表述中需要注意的几个问题[J];第三军医大学学报;2009年14期

5 瞿海龙;边剑飞;张冰;王颖;周英莲;;间充质干细胞临床应用的前景与困惑[J];医学研究与教育;2011年05期

6 郭子宽;;间充质干细胞及其临床应用中的几个问题[J];中国组织工程研究;2012年01期

7 李炳尧;武晓云;吴岩;;间充质干细胞的分离与培养:从实验室到临床[J];中国组织工程研究;2013年14期

8 吴实;邓列华;;皮肤间充质干细胞在促进皮肤愈合中的作用[J];实用皮肤病学杂志;2013年03期

9 吴清法,王立生,吴祖泽;间充质干细胞的来源及临床应用[J];军事医学科学院院刊;2002年03期

10 黄定强;间充质干细胞的研究进展[J];国外医学(耳鼻咽喉科学分册);2003年03期

相关会议论文 前10条

1 陈可;王丁;韩之波;朱德林;韩忠朝;;人脐带间充质干细胞体外发挥免疫活性的研究[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年

2 金明顺;张毅;贾秀芬;周燕华;闫妍;刘慧雯;;小鼠脂肪间充质干细胞的分离、培养以及多潜能分化的研究[A];中国解剖学会第十一届全国组织学与胚胎学青年学术研讨会论文汇编[C];2009年

3 李争艳;刘杨;翟丽丽;杨迷玲;王立峰;;间充质干细胞在肿瘤发展过程中的作用[A];中华医学会病理学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年

4 张彦;李尚珠;;间充质干细胞在血管工程中的机制及应用[A];2009全国中西医结合周围血管疾病学术交流会论文集[C];2009年

5 石玉;戴\戎;;周期性拉应力对间充质干细胞分化影响的研究[A];第九届全国生物力学学术会议论文汇编[C];2009年

6 黎娇;朱争艳;杜智;骆莹;王鹏;高英堂;;人脐带间充质干细胞分泌物对肝细胞增殖和凋亡的影响[A];天津市生物医学工程学会第30次学术年会暨生物医学工程前沿科学研讨会论文集[C];2010年

7 谭远超;Kevin;姜红江;黄相杰;周纪平;;间充质干细胞在骨伤疾病治疗中的应用[A];首届全国中西医结合骨科微创学术交流会暨专业委员会成立大会论文汇编[C];2011年

8 唐佩弦;;间充质干细胞及其临床应用前景[A];第三届全国血液免疫学学术大会论文集[C];2003年

9 戴育成;;间充质干细胞的生物学特性和应用[A];2005年华东六省一市血液病学学术会议暨浙江省血液病学学术年会论文汇编[C];2005年

10 胡琳莉;王昕荣;钱坤;李舟;杨薇;朱桂金;;小鼠间充质干细胞向子宫内膜分化的实验研究[A];第一届中华医学会生殖医学分会、中国动物学会生殖生物学分会联合年会论文汇编[C];2007年

相关重要报纸文章 前10条

1 满学杰;天津滨海新区建最大间充质干细胞生产基地[N];新华每日电讯;2008年

2 满学杰;津昂赛打造间充质干细胞生产基地[N];医药经济报;2008年

3 第三军医大学西南医院输血科 李忠俊 整理 吴刘佳;间充质干细胞研究又见新方法[N];健康报;2013年

4 上海生科院 上海交大医学院健康科学研究所 曹楷;间充质干细胞：干细胞中的孙悟空[N];上海科技报;2014年

5 记者　陈建强;首家间充质干细胞库在津建成[N];光明日报;2006年

6 记者　冯国梧;细胞产品国家工程中心建设方案获准[N];科技日报;2007年

7 实习生 刘霞;间充质干细胞有望用于面部整形[N];科技日报;2007年

8 本报记者 王新佳;我国“原始间充质干细胞”注射液进入临床研究[N];中国高新技术产业导报;2005年

9 冯国梧;全球首个脐带间充质干细胞库规模化运营[N];科技日报;2008年

10 刘莹清;全球首个脐带间充质干细胞库泰达规模运营[N];北方经济时报;2008年

相关博士学位论文 前10条

1 王皓;五指山小型猪OCT-4、SOX-2基因在骨髓间充质与脐带间充质干细胞中的过表达研究[D];中国农业科学院;2013年

2 孔德晓;间充质干细胞及胰岛素分泌细胞治疗糖尿病的临床及应用基础研究[D];山东大学;2015年

3 董苑;SDF-1复合PDPBB的构建及对间充质干细胞趋化影响的研究[D];昆明医科大学;2015年

4 王磊;诱导胎盘来源间充质干细胞向成牙骨质细胞分化的实验研究[D];山东大学;2015年

5 房贺;连接黏附分子A在促进MSC修复CC14肝损伤中的作用及其机制[D];第二军医大学;2015年

6 陈洁;间充质干细胞外泌体对急性肺损伤小鼠的影响及相关机制的实验研究[D];中国人民解放军医学院;2015年

7 许婷;转化生长因子β1在蟑螂过敏原诱导的哮喘中对间充质干细胞募集迁移的影响[D];南方医科大学;2015年

8 周雅丽;携氧间充质干细胞对胃癌化疗效果的影响及其机制研究[D];兰州大学;2015年

9 沈舒宁;CKIP-1负调控间充质干细胞成骨分化研究[D];第四军医大学;2015年

10 朱镇;外源性骨矿化蛋白1转染人胎盘源间充质干细胞及其蛋白质组研究[D];吉林大学;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 李超;小鼠骨髓间充质干细胞中AC基因亚型的表达及AC3对其纤毛长度的影响[D];河北大学;2015年

2 林涛;壳聚糖水凝胶复合脂肪间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的实验研究[D];川北医学院;2015年

3 彭龙英;心肌营养素1促进人脐血间充质干细胞神经分化存活及PI3K/Akt信号通路机制研究[D];遵义医学院;2015年

4 乔晓慧;酸性环境对人脐带间充质干细胞的影响[D];内蒙古大学;2015年

5 张红霞;人脐带间充质干细胞的分离、鉴定及其对人肺癌细胞恶性表型的影响[D];内蒙古大学;2015年

6 顾立超;BTK抑制剂对间充质干细胞miR-21的调节作用[D];河北联合大学;2014年

7 王文杰;鸭胚间充质干细胞生物学特性及其移植修复肝损伤研究[D];中国农业科学院;2015年

8 张猛;血管内皮前体细胞对间充质干细胞分化潜能的影响[D];石河子大学;2015年

9 马丽媛;利用MyoD基因诱导绵羊脐带间充质干细胞分化为成肌细胞的研究[D];东北林业大学;2015年

10 宋维文;MicroRNA-133诱导绵羊间充质干细胞分化为成肌细胞的研究[D];东北林业大学;2015年

，

本文编号：2211469