烟曲霉对造血干细胞移植患者中性粒细胞吞噬功能的影响及机制研究

  烟曲霉是自然界广泛存在的真菌,可以引起免疫功能低下患者的严重机会感染。近20年来,随着造血干细胞移植(Hematopoietic Stem Cell Transplantation,HSCT)技术的快速发展,造血干细胞移植的患者越来越多,而造血干细胞移植患者伴随感染的机会也明显增高。恶性肿瘤、粒细胞减少或功能障碍、糖皮质类固醇和免疫抑制剂的使用等原因造成的患者免疫功能缺陷,导致侵袭性曲霉病发病率不断上升。目前造血干细胞移植患者免疫功能抑制而感染侵袭性曲霉病是造血干细胞移植后死亡的主要原因。中性粒细胞(PMN)是机体防御系统的重要组成部分,它通过吞噬等方式来抵御和消灭入侵的病原微生物,与机体的非特异性抗感染过程有关,该类细胞具有强大的吞噬杀菌功能,其作用过程历经趋化运动,识别并结合吞噬物质,进而摄入胞内,最终杀伤并降解病原体。烟曲霉的代谢产物(Af D)可通过抑制免疫反应或破坏局部组织从而导致人及动物的侵袭性曲霉病。而对于免疫功能正常的人来说,吞噬的烟曲霉菌易被PMN细胞杀灭并清除。但关于造血干细胞移植后患者中性粒细胞的功能、对曲霉菌的吞噬作用改变及机制尚未完全清楚。因此本论文以健康人和造血干细胞移植患者(4-6周)外周血PMN细胞为研究对象,在体外培养条件下给予烟曲霉孢子及其代谢产物在刺激后,分别应用光镜、电镜技术观察中性粒细胞的形态学、流式细胞仪检测中性粒细胞体积大小、呼吸爆发产生超氧离子(O2-)水平、中性粒细胞表面CD64表达水平及其吞噬率和吞噬指数的改变,探讨造血干细胞移植患者PMN对烟曲霉和其代谢产物混合作用的反应性,初步探讨造血干细胞移植患者易患烟曲霉病的可能机制。首先利用新方法分离和纯化外周血健康人和造血干细胞移植患者的PMN,经姬姆萨染液染色后确认可制得纯度95%的PMN细胞。台盼蓝排斥法测PMN细胞活性98%。光镜下我们发现健康人的PMN细胞核呈杆状或2~5分叶状,叶与叶间有细丝相连,造血干细胞移植患者中性粒细胞胞浆核增大,中幼至分叶核嗜酸性粒细胞部分明显增大;通过扫描电镜发现健康人PMN细胞体积大小基本相同,造血干细胞移植患者PMN细胞体积大小有差异,其细胞平均体积比健康人大,这与流式细胞技术检测PMN细胞体积大小结果相符。上述结果说明造血干细胞移植患者血液中的PMN多以不成熟的幼稚状态存在。接下来将烟曲霉孢子及代谢产物与分离所得的高纯度中PMN细胞共同孵育2小时,然后利用PAS(Periodic Acid-Schiff)染色、电镜技术和流式细胞术观察中性粒细胞的形态学变化与吞噬功能的关系。加入孢子混合液(烟曲霉孢子+Af D)刺激PMN2小时后透射电镜下我们发现健康人PMN细胞对烟曲霉孢子的吞噬率和吞噬指数在Af D存在与不存在的情况下无明显改变,但造血干细胞移植患者PMN同时粘附和吞噬孢子数比健康人少,线粒体肿胀明显,内质网扩张,并可见部分胞质内局灶性坏死;更为显著的是PAS染色后也发现Af D可以显著抑制造血干细胞移植患者PMN细胞对烟曲霉孢子的吞噬率和吞噬指数;通过流式细胞术检测PMN细胞内含有CFSE标记的烟曲霉孢子的数量进一步证实了Af D抑制HSCT患者PMN细胞吞噬烟曲霉孢子能力的影响。为了进一步探索影响造血干细胞移植患者PMN细胞吞噬功能改变的可能机制,我们通过运用流式细胞仪检测PMN细胞活性氧分析呼吸爆发产生O2-水平;通过流式细胞术检测其表面CD64表达水平分析中性粒细胞抗感染能力。流式检测结果显示造血干细胞移植患者PMN经孢子混合液(烟曲霉孢子+Af D)刺激后PMN呼吸爆发产生O2-水平明显低于健康人群,而且Af D对造血干细胞移植患者PMN细胞O2-产生的抑制作用显著高于健康人PMN。我们推测Af D的细胞毒素所致的O2-产生水平的下降可能与造血干细胞移植患者PMN抗烟曲霉菌的能力降低密切相关。造血干细胞移植患者PMN表面CD64表达在烟曲霉孢子+Af D刺激前后期表达无明显变化,但造血干细胞移植患者PMN细胞CD64本底表达水平显著低于健康人PMN细胞,这可能与HSCT中性粒细胞呼吸爆发水平降低有关。通过以上实验研究,我们推测造血干细胞移植患者PMN细胞对易感烟曲霉菌与其吞噬功能的降低及其PMN细胞呼吸爆发产生低水平O2-和其本身CD64呈低水平表达密切相关;Af D显著抑制造血干细胞移植患者PMN细胞的吞噬功能、活性氧产生;且进一步证明了健康人和造血干细胞移植患者的中性粒细胞形态与结构的变化和其功能变化的相关性,但关于Af D对造血干细胞移植患者PMN细胞吞噬功能影响的具体机制仍需要进一步探讨。

【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R457.7
【目录】：

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 钱晶晶;管怀进;朱昌来;;体外培养细胞原位包埋电镜样品的制作方法[J];南京医科大学学报(自然科学版);2013年05期

2 王志永;姜尔烈;张平;王华;包宇实;王玫;冯四洲;韩明哲;;异基因造血干细胞移植后侵袭性真菌感染及其危险因素分析[J];中国实验血液学杂志;2008年03期

【共引文献】

中期刊全文数据库 前10条

1 林德健,梁月婵;规范输血科管理 防范医疗事故和纠纷[J];安徽卫生职业技术学院学报;2004年03期

2 程越;卫玉芝;杨鹏;张循善;;血浆置换抢救重症蜂蜇伤致多器官功能衰竭12例临床分析[J];安徽医药;2010年12期

3 陈美华;魏薇萍;;急诊护士对安全输血认知情况的调查与分析[J];蚌埠医学院学报;2011年03期

4 孙彦,王岩青,王世泉,孙炜,孙文海;稀释式自身输血在头颈癌手术治疗中的应用[J];青岛大学医学院学报;2001年01期

5 陈莉;;一例M2引起的血型变异[J];北方药学;2012年03期

6 付步芳;奚廷斐;王祎;夏红英;高波;;血袋中的还原物质对袋装全血质量的影响研究[J];北京生物医学工程;2008年04期

7 王葆昶;;不规则抗体产生原因浅析[J];北京医学;2008年12期

8 梁华钦,王水邦,田兆嵩,江朝富;溶血对抗-HCV检测结果的影响[J];中国输血杂志;1996年02期

9 罗时定,姚彩霞,勾洪涛,戴云霞,王立松,谢茂华;单采血浆兼采一程白膜后献血者血细胞计数的探讨[J];中国输血杂志;1996年02期

10 柯贤军,刘光建;自血光量子疗法治疗重度一氧化碳中毒30例[J];中国输血杂志;1999年03期

中国博士学位论文全文数据库 前5条

1 周华友;人类RH基因结构与遗传特点研究[D];第一军医大学;2004年

2 羊书勇;富含血小板血浆应用于骨组织工程的研究[D];第四军医大学;2005年

3 哈肖别克·卡斯木;主要组织相容性复合体Ⅰ类分子相关A基因（MICA）抗体与临床肝移植排斥的相关性实验研究[D];新疆医科大学;2008年

4 渠柏艳;基于血液样品和微流控芯片技术的细胞分离、PCR扩增及DNA测序方法研究[D];东北大学;2009年

5 孙英新;螺旋藻藻蓝蛋白抗百草枯诱导大鼠肺纤维化的研究[D];中国科学院研究生院（海洋研究所）;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 王慧丽;异基因造血干细胞移植后早期细胞菌感染的临床分析[D];新疆医科大学;2011年

2 张小梅;异基因造血干细胞移植后侵袭性真菌病的临床分析[D];新疆医科大学;2011年

3 董河;自体输血与少白细胞异体输血对肿瘤手术病人免疫功能的影响[D];青岛大学;2003年

4 王蕊;ABO血型不合的外周血干细胞移植及输血[D];新疆医科大学;2004年

5 陈东;健康志愿者万汶急性扩容容量动力学研究[D];天津医科大学;2005年

6 刘进;人红细胞血型糖蛋白A单克隆抗体的制备[D];扬州大学;2006年

7 付步芳;一次性塑料血袋中还原物质的分析及其安全性研究[D];中国药品生物制品检定所;2007年

8 高晓飞;人红细胞血型糖蛋白B单克隆抗体的制备[D];扬州大学;2007年

9 张海燕;人源Fab抗体库的构建及RH（D）抗体的筛选与其特性检测[D];扬州大学;2007年

10 汪小华;张家界市血液来源及血液质量的研究[D];中南大学;2006年

【二级参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 于向民,野田亨,房丽华,李玲;盖玻片在培养细胞免疫电子显微术中的应用(英文)[J];电子显微学报;2004年01期

2 赵刚,曾嘉,杨海贤;培养细胞的超薄切片技术探讨[J];天津医科大学学报;2004年02期

3 徐晶;田香勤;李新娟;蔡新华;;培养细胞超薄切片制备方法改进[J];新乡医学院学报;2009年01期

4 黄晓军;血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌感染的诊断标准与治疗原则(草案)[J];中华内科杂志;2005年07期

5 许兰平;纪宇;刘代红;陈育红;韩伟;刘开彦;黄晓军;;造血干细胞移植后患者侵袭性真菌感染发生及危险因素分析[J];中华内科杂志;2007年06期