GLP-1通过TRPM2调节葡萄糖刺激的胰岛素分泌

发布时间：2018-10-04 19:45

【摘要】：目的瞬时感受器电位(transient receptor potential,TRP)超家族是一组非选择性阳离子通道,分为7个亚家族,TRPM亚家族包括8个不同的成员,TRPM1~8。TRPM2在可兴奋细胞和非兴奋细胞上广泛表达,其中胰岛beta细胞上也发现了TRPM2的表达,同时它可以形成Ca2+通透性阳离子通道,在胰岛beta细胞的胰岛素分泌功能中发挥一定的作用。TRPM2通道可以被细胞内的环磷酸腺苷(cAMP)、H2O2、活性氧(ROS)、温度以及Ca2+所激活。众所周知,作为2型糖尿病的一个重要靶点,胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide1,GLP-1)具有保护胰岛beta细胞,刺激其增值和分化,抑制其凋零,增加胰岛beta细胞数量,减轻病人体重,抑制胃肠蠕动和胃液分泌,抑制食欲,延缓胃排空促进胰岛素的合成和分泌等作用,然而在它众多作用当中我们对其可以增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion,GSIS)作用最感兴趣并进行了进一步的深入研究。GLP-1的促胰岛素分泌作用呈葡萄糖浓度依赖性,即只有在血糖水平升高的情况下,GLP-1才发挥降糖作用,而在血糖水平正常时,则不会使其进一步降低。GLP-1的这种葡萄糖浓度依赖性方式促进胰岛beta细胞分泌胰岛素,同时减少胰岛alpha细胞分泌胰高血糖素,从而降低血糖。细胞外葡萄糖浓度的变化将改变细胞内ATP以及cAMP的水平,c AMP水平的变化将影响表达在胰岛beta细胞上的TRPM2的状态,因此这些研究结果促使我们提出了以下设想:TRPM2有可能参与了GLP-1调节胰岛素分泌的功能。本研究将结合GLP-1和TRPM2作为新视点探索并揭示胰岛素分泌调节的发生机制,为预防治疗糖尿病以及其并发症开辟了新的道路。方法选取健康Sprague-Dawley大鼠,分离并培养原代细胞。在室温(22-25oC)下用膜片钳放大器测量细胞膜电流。采用PCLAMP v.10.2软件以及Digidata-1440A来发出指令点刺激并记录数据。将细胞置于位于倒置显微镜载物台上的bath(近似0.15 ml,被维持在37 oC)中,然后以HEPES缓冲的生理盐水(含3.3mmol/L葡萄糖),高糖、高K+、TRPM2激动剂、TRPM2抑制剂、PKA激动剂和抑制剂、Epac激动剂和抑制剂或10 nM的GLP-1等分子进行孵育,流速为5 ml/min的进行(原代细胞用电阻系数约为4.5 MΩ的玻璃电极),记录离子通道电流以及通过记录电容变化比较不同实验组中胰岛素分泌的差异,并且通过连续的去极化刺激初步观察上述刺激对两相胰岛素分泌的影响。经过基因静默和过表达处理的胰岛beta细胞,也给予上述分子孵育,记录离子通道电流、电容变化,并测量胰岛素分泌水平。对基因静默组及过表达组利用Western Blot,RT-PCR及电生理学测量来确定TRPM2的表达及活性水平。并对各组通过膜片钳全细胞记录法记录离子通道的细胞膜电流强度情况来确定其活性程度,同时利用胰岛素分泌实验加以佐证来确定TRPM2的活性或其表达水平是否与GLP-1的胰岛素分泌调节作用相关。结果1.不同浓度葡萄糖刺激对TRPM2的影响:将原代细胞置于37摄氏度的高糖、正常糖溶液及低糖环境中15分钟,对照组和低糖组之间TRPM2电流无明显差异(P0.05),高糖组TRPM2电流强度峰值高于对照组(P0.05)。2.高钾及GLP-1对TRPM2的影响:10 nM GLP-1刺激原代细胞后利用全细胞记录法记录TRPM2的峰值电流,与对照组相比GLP-1刺激可以显著增强TRPM2电流强度(P0.05)。30 m M KCl刺激对TRPM2无影响(P0.05)。3.TRPM2基因静默对胰岛素分泌的影响:对对照组和siTRPM2组给予不同糖浓度刺激,分别测量0-10分钟(一相分泌)以及10-60分钟(二相分泌)的胰岛素分泌水平。si TRPM2组与对照组相比,低糖和正常糖浓度水平下胰岛素分泌情况无明显差别(P0.05),但在高糖水平下胰岛素一相分泌及二相分泌水平较对照组明显下降(P0.05)。4.高钾及GLP-1对胰岛素分泌的影响:低糖水平下,si TRPM2组,GLP-1组,GLP-1+siTRPM2组胰岛素分泌较对照组无明显变化(P0.05)。KCl刺激以上各组后胰岛素分泌水平较对照组均明显增加(P0.05)。高糖水平下,GLP-1组胰岛素分泌较对照组明显增多(P0.05),GLP-1+si TRPM2胰岛素分泌水平与对照组无差别(P0.05)。KCl处理各组后与各组此前的胰岛素分泌水平相比无明显变化(P0.05)。5.2-APB对GLP-1介导的GSIS影响:10μM 2-APB可显著抑制过表达组及对照组TRPM2电流,GLP-1在高糖水平时可使胰岛素分泌水平增加,而2-APB可以使GLP-1组的胰岛素分泌水平降低至对照组水平,较之GLP-1组明显下降(P0.05)。6.PKA、Epac的激动剂及抑制剂对GLP-1介导的GSIS的影响:PKA激动剂及抑制剂对TRPM2电流无显著影响(P0.05)。与对照组相比,PKA激动剂可以显著增加GSIS。与GLP-1组相比,PKA抑制剂对GLP-1的促泌作用无明显影响(P0.05)。Epac激动剂可以显著增强TRPM2电流,在Epac抑制剂的作用下GLP-1增强TRPM2电流的效果消失。同时Epac激动剂可以显著提升GSIS,在其作用下GLP-1的加入无法进一步促进胰岛素分泌,而Epac抑制剂可抑制GLP-1的胰岛素促泌作用(P0.05)。结论高浓度葡萄糖刺激可以增强TRPM2电流强度,低糖对TRPM2电流无影响。TRPM2参与了葡萄糖刺激的第一时项及第二时项的胰岛素分泌。高钾对TRPM2通道活性无影响,GLP-1可激活TRPM2,并通过此途径调节胰岛素分泌,KATP-Cav通路未参与GLP-1介导的GSIS。GLP-1通过Epac通路而非PKA通路调节GSIS,PKA通路通过其他作用机制调节GSIS,此调节作用与GLP-1的GSIS调节作用互补。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.1

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本文编号：2251642