苏木酮A对顺铂所致肾损伤的保护作用及其机制研究

发布时间：2018-10-09 12:09

【摘要】：第一部分苏木酮A抗顺铂所致小鼠肾损伤的保护作用及机制目的:顺铂(Cisplatin,CP)作为抗肿瘤常用的最有效化疗药物应用之一,在治疗的同时,可产生肾毒性损伤,影响其临床应用。本部分采用动物实验,从整体水平上观察苏木酮A(Sappanone A,SA)能否逆转或改善顺铂所致肾组织毒性损伤,并通过观察氧化应激、炎症反应和细胞凋亡的变化,探讨其可能的保护机制。方法:将Balb/c小鼠随机分为5组(每组n=8只)。(1)空白对照组(Control);(2)CP组(20 mg/kg);(3)CP+SA低剂量组(10 mg/kg);(4)CP+SA中剂量组(20 mg/kg);(5)CP+SA高剂量组(40 mg/kg)。联合用药组提前3天给予苏木酮A预处理,顺铂给药后4天,处死动物,留取血、肾标本。生物化学方法检测血清中BUN和Cr的含量;HE染色光学显微镜观察肾脏组织病理学变化;TUNEL检测肾组织细胞的凋亡率;生物化学方法检测血清SOD酶活性及肾组织MDA含量;荧光定量PCR检测肾组织中TNF-α、IL-1β、Nrf2和HO-1 mRNA表达。ELISA法检测TNF-α、IL-1β蛋白水平表达,Western blot法检测肾组织中HO-1、p-p65、P65、IκB、p-IκB和Nrf2表达变化。结果:1苏木酮A能够改善顺铂所致的肾功能损伤:CP组小鼠血清中BUN和Cr的含量均显著高于Control组;CP+SA各剂量组小鼠血清中BUN和Cr的含量均显著低于CP组,呈剂量依赖性(P0.05)。2苏木酮A能够改善顺铂所致的肾组织损伤:CP组肾组织损伤程度严重,肾小管重度颗粒空泡变性,部分肾小管刷毛缘脱落,局部胞浆崩解,小管内可见细胞碎片;而CP+SA组小鼠的肾组织损伤较顺铂组明显减轻,尤以高剂量组减轻明显。3苏木酮A能够降低顺铂所致肾小管上皮细胞凋亡:CP组小鼠肾小管上皮细胞凋亡率显著高于Control组(P0.05);CP+SA各剂量组小鼠肾组织细胞凋亡率均显著低于CP组(P0.05)。4苏木酮a能够缓解顺铂所致的肾组织氧化应激水平:与control组比较,cp组小鼠肾组织中sod酶活性显著降低(p0.05)而mda含量显著增加;与cp组比较,cp+sa各剂量组小鼠血清中sod酶活性均明显升高(p0.05)而肾组织中mda含量均显著减少(p0.05),呈剂量依赖性。5苏木酮a能够降低顺铂所致的肾组织p-nf-κbp65的表达:westernblot结果显示:cp组小鼠肾组织中p-p65、p-iκb表达显著高于control组(p0.05),而iκb表达下降;当用顺铂与苏木酮a联合给药后,小鼠肾组织中p-p65、p-iκb表达显著低于cp组、iκb表达上调(p0.05),且随着苏木酮a浓度的增加,p-nf-κb表达逐渐降低,呈剂量依赖性。6苏木酮a能够降低顺铂所致的肾组织的炎症反应:与control相比,cp组小鼠肾组织中tnf-α、il-1βmrna和蛋白相对表达量均明显增高(p0.05)而nrf2、ho-1mrna和蛋白相对表达量则均显著降低(p0.05);sa能够逆转cp引起的上述改变,且呈剂量依赖性。小结:1苏木酮a能够减轻顺铂所致肾组织结构损伤和细胞凋亡,改善肾功能。2苏木酮a抗顺铂导致的肾组织细胞毒性损伤作用可能是通过提高nrf2表达,从而调控其下游相关基因而发挥抗氧化作用、抗炎症和抗细胞凋亡作用而实现的。第二部分苏木酮a抗顺铂所致hk-2细胞毒性作用及机制目的:本研究选用人肾近曲小管上皮细胞株(hk-2细胞)为研究对象,从细胞水平上探讨苏木酮a(sappanonea,sa)抗顺铂所致细胞毒性作用。方法:体外培养hk-2细胞,实验分3组。(1)空白对照组(dmso组);(2)顺铂组(cp组,5μm);(3)苏木酮a联合顺铂组(5μmcp+10μmsa组、5μmcp+20μmsa组及5μmcp+30μmsa组)。于cp给药前1小时加入sa。流式细胞术检测细胞凋亡率;elisa法检测细胞培养上清中tnf-α、il-1β蛋白水平;生化法检测细胞中mda、·oh蛋白含量;westernblot检测p-p65、p65、iκb、p-iκb和nrf2蛋白表达。结果:1sa能够逆转cp所致的肾小管上皮细胞毒性损伤mtt结果显示:与对照组相比,cp对hk-2细胞具有显著的细胞毒作用,细胞生长受抑制,增殖水平明显下降;与cp组相比,经sa预处理后,cp+sa组hk-2细胞的增殖水平显著上调,呈剂量依赖性。2sa预处理能够降低cp所致的肾小管上皮细胞凋亡率流式细胞术结果显示,与control组相比,cp组hk-2细胞凋亡率明显增高[(38.06±2.38)%];与单用顺铂组相比,cp+sa联合用药组hk-2细胞凋亡百分率显著减少[(30.65±1.21)%,(28.23±2.33)%和(20.89±3.23)%],并随着苏木酮a的作用浓度增加,细胞的凋亡率随之降低(p0.05)。3sa预处理能够降低cp所致肾小管上皮细胞炎症因子tnf-α和il-1β的释放elisa检测结果显示:cp组hk-2细胞培养上清中tnf-α和il-1β蛋白的含量明显高于control组(p0.05);cp+10μmsa、cp+20μmsa组、cp+30μmsa各联合给药组hk-2细胞培养上清中tnf-α和il-1β蛋白的含量均明显低于cp组(p0.05),且随着苏木酮a浓度的增高而逐渐降低。4sa能降低cp所致hk-2细胞氧化应激水平生化法检测mda、·oh含量检测结果显示:与control组比较,cp组hk-2细胞中mda、·oh含量显著增高(p0.05);当用cp与sa联合给药后,cp+10μmsa、cp+20μmsa组、cp+30μmsa的hk-2细胞中mda、·oh含量显著低于cp组小鼠(p0.05),且随着sa给药浓度的增加,mda、·oh含量逐渐降低,呈剂量依赖性5sa能够降低cp所致的肾小管上皮细胞中p-nf-κbp65蛋白表达而上调nrf2蛋白表达水平westernblot结果显示:与control比较,cp组hk-2细胞中p-p65和p-iκb蛋白的表达水平显著增高(p0.05);cp+10μmsa、cp+20μmsa组、cp+30μmsa各联合给药组hk-2细胞中p-p65和p-iκb蛋白的表达水平显著低于cp组(p0.05),且随着苏木酮a给药浓度的增加,p-p65,p-iκb蛋白的表达水平逐渐降低,呈剂量依赖性。与control相比,cp组hk-2细胞中nrf2核蛋白相对表达量则显著降低(p0.05);sa能够逆转cp引起的上述改变,且呈剂量依赖性。小结:苏木酮a具有抗顺铂所致hk-2细胞的细胞毒性作用,其作用可能与提高核蛋白nrf2的表达、降低nf-κb活化从而抑制炎症反应、氧化应激和细胞凋亡有关。第三部分nrf2信号通路在苏木酮a抗顺铂所致hk-2细胞毒性中的作用目的:nrf2/are信号转导通路为人类机体内最为重要的内源性防御体系,在抗氧化应激、抗炎反应、抗细胞凋亡和抗组织器官损伤保护等方面发挥重要作用。本部分在前两部分实验的基础上,敲低nrf2表达后,观察sa和顺铂联合用药的hk-2细胞细胞凋亡、氧化应激、nf-κb活性及il-1β释放的变化,深入探讨nrf2信号通路在sa抗cp所致肾小管上皮细胞损伤中的确切作用。方法:将含有nrf2sirna的片段克隆入慢病毒载体pglv3-gfp中,随后将该载体转染293t细胞,包装出含有nrf2sirna的病毒并将之感染hk-2细胞,构建nrf2沉默表达的hk-2细胞系。实验分为8组(n=3):(1)正常对照组(nc组);(2)cp组;(3)sa组;(4)cp+sa组;(5)nrf2sirna转染组;(6)cp+nrf2sirna转染组;(7)sa+nrf2sirna转染组;(8)cp+sa+nrf2sirna转染组。流式细胞术和tunel染色检测细胞凋亡率;比色法检测细胞氧化应激反应(·oh、mda含量);westernblot法检测细胞中ho-1、nrf2和p-p65蛋白表达;elisa技术检测培养上清中il-1β含量。结果:1下调nrf2表达能够逆转sa对抗cp致hk-2细胞凋亡的保护作用:流式细胞术和tunel结果显示,cp能够诱导hk-2细胞发生细胞凋亡,而sa能够逆转cp所致细胞凋亡,但敲低nrf2表达后sa并不能逆转cp所致的hk-2细胞凋亡,肾小管上皮细胞凋亡率显著升高;2下调nrf2表达能够逆转sa对cp致hk-2细胞氧化应激反应的保护作用:与正常对照组相比,cp组细胞中·oh和mda含量均明显增加(p0.05);与cp组相比,sa+cp组细胞中·oh和mda含量均明显减少(p0.05);敲低nrf2基因的sa+cp组hk-2细胞中·oh和mda含量增加(p0.05)。3下调nrf2表达能够降低sa和cp联合用药组中ho-1蛋白的表达:westernblot法检测各组细胞内ho-1蛋白表达,结果显示:与非转染各组(对照组)相比,敲低nrf2基因的各组hk-2细胞中ho-1的蛋白表达均明显降低,(p0.05);尤其是与cp组相比,cp+sirna组ho-1蛋白表达显著降低;与cp+sa组相比,cp+sa+sirna组ho-1蛋白表达更低;4下调nrf2表达能够上调sa和cp联合用药组中p-nf-κbp65蛋白表达:cp能够上调hk-2细胞中p-nf-κbp65蛋白表达,而sa能够降低cp介导的p-nf-κbp65表达;与cp+sa组相比,cp+sa+sirna组中p-nf-κbp65蛋白显著上调;5下调nrf2表达能够上调sa和cp联合用药组hk-2细胞培养上清中il-1β含量:elisa结果显示,与cp组,cp+sirna组hk-2细胞培养上清中il-1β含量显著增多,cp+sa组反而降低;而与cp+sa组相比,cp+sa+sirna组hk-2细胞培养上清中il-1β含量却显著升高,差异具有统计学意义。小结:1敲低hk-2细胞中nrf2表达能够上调hk-2细胞的凋亡率,加重cp诱导的hk-2细胞凋亡,逆转sa对抗cp致hk-2细胞损伤,提示sa通过激活nrf2,对抗cp所致的hk-2细胞凋亡的发生具有减轻细胞毒性的作用。2敲低nrf2蛋白后,ho-1蛋白相对表达量明显降低,提示sa减轻cp细胞毒性作用可能通过上调nrf2蛋白表达,从而增加ho-1蛋白表达,抑制氧化应激、降低肾小管上皮细胞凋亡有关。3敲低nrf2蛋白表达,能够促进p-p65蛋白的表达,促进细胞外il-1β的释放,提示sa可能通过激活nrf信号通路,抑制nf-kb的活化,抑制炎症因子的释放,从而发挥抗cp介导的肾小管上皮细胞的损伤。结论:1苏木酮a能够逆转顺铂所致的肾损伤,可能与改善炎症反应和/或氧化应激,从而降低肾小管上皮细胞凋亡有关。2苏木酮A通过上调Nrf2蛋白表达,从而增加HO-1蛋白表达,抑制氧化应激;抑制NF-κB激活,降低炎症介质释放,降低肾小管上皮细胞凋亡,逆转CP所致的肾小管上皮细胞损伤。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

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