TIGIT和PD-1介导泡型包虫病患者T淋巴细胞免疫耗竭的研究

发布时间：2018-10-22 11:56

【摘要】：目的:泡型包虫病(Alveolar Echinococcosis,AE)类似侵袭性生长的“肝癌”。目前大量的研究工作表明,宿主的免疫状态是影响多房棘球蚴(Echinococcus multilocularis,E.m)感染寄生、病灶活性及疾病转归的重要因素。本研究旨在探讨免疫抑制性分子TIGIT和PD-1介导肝AE患者T细胞免疫耗竭的机制。方法:第一部分,1.利用26例AE患者肝脏手术标本,病理切片观察肝脏病灶周围“活跃浸润增殖区-炎症微环境”形成,以及炎性细胞浸润和肝脏病理表现;利用Masson染色和免疫组织化学检测AE患者肝脏纤维化程度和肝星状细胞的活化,实时荧光定量验证α-SMA、COL1A1和COL3A1的表达变化;免疫荧光技术鉴定肝脏病灶周围“炎症微环境”募集的关键免疫细胞亚群;血清学测定肝损伤特异性指标ALT和AST。2.利用6例AE患者肝脏手术标本,通过高通量技术筛选肝脏区域关键免疫抑制性分子表达变化;实时荧光定量验证筛选的部分差异表达基因,分析免疫抑制性分子与T淋巴细胞表面特异性标记分子、抑制性炎性因子的相关性。第二部分,1.利用20例AE患者肝脏手术标本,胶原酶消化分离肝脏淋巴细胞,流式细胞术检测病灶近旁肝脏组织与远端肝脏组织T细胞的比例,及其表面TIGIT和PD-1表达变化,分析其比例变化与AE患者病灶活性的关系;利用免疫荧光技术等技术检测TIGIT和PD-1免疫定位和共定位,及其配体CD155和PD-L1的细胞定位;利用体外细胞刺激实验,流式细胞术检测近旁肝脏组织TIGIT或PD-1阳性群T细胞与阴性群T细胞分泌Granzyme B、perforin、IFN-γ和TNF-α的差异变化。2.利用45例AE患者和健康志愿者外周血标本,密度梯度离心分离淋巴细胞,流式细胞术检测T细胞的比例及其表面TIGIT和PD-1表达变化,分析与AE患者病灶活性关系;分析T细胞表面TIGIT和PD-1表达与血清虫体特异性抗体Em2水平相关性;利用体外细胞刺激实验,流式细胞术检测AE患者外周血TIGIT或PD-1阳性群T细胞与阴性群T细胞增殖能力的变化,及其分泌Granzyme B、perforin、IFN-γ和TNF-α的差异;进一步通过TIGIT和PD-1抗体封闭,检测T细胞增殖能力的变化。第三部分(1)建立低(50,250 PSCs)、中(500 PSCs)、高(1000,2000 PSCs)三种不同剂量泡球蚴经肝门静脉感染小鼠模型,大体观察和分析不同剂量小鼠模型肝脏表面病灶的大小和数量;病理切片观察肝脏免疫病理变化、微观病灶数量、肉芽肿反应类型;天狼星红染色和免疫组织化学检测肝纤维化程度和肝星状细胞的活化,实时荧光定量验证α-sma和col1a1的表达变化。2.分离肝脏单个核细胞,流式细胞术检测不同淋巴细胞绝对数,t淋巴细胞表型变化(cd69,cd44和cd62l),以及不同t细胞亚群(t1、t2、t17和treg型)比例变化;实时荧光定量检测肝脏组织t细胞亚群相关细胞因子的表达变化。3.通过不同剂量e.m感染小鼠模型,流式细胞术检测肝脏区域和脾脏t细胞表面tigit和pd-1表达变化,以及共表达情况;利用体外细胞刺激实验,流式细胞术检测tigit或pd-1阳性群t细胞与阴性群t细胞分泌granzymeb、cd107a、ifn-γ和tnf-α的差异变化。结果:第一部分,1.ae患者肝脏病灶周围形成“炎症微环境”,主要以cd8~+t淋巴细胞浸润为主炎性细胞带,伴随cd4~+t淋巴细胞、巨噬细胞和成纤维细胞浸润。2.基因芯片高通量筛选,发现ae患者肝脏病灶周围免疫反应相关趋化因子(ccl3、ccl8、ccl17、ccl18、ccl19、ccl21、ccl26)、淋巴细胞表面分子(cd69、cd44、cd1e、cd8b、cd27)、免疫抑制性分子(ctla4、crtam、btla、tigit)和炎性细胞因子(il-10、ifn-γ、ido1)等呈上调表达,其中tigit、il-10和ifn-γ基因的上调倍数分别为2.07、3.72和3.19;通过实时荧光定量验证和相关性分析显示,tigit和pd-1分子分别与cd4(tigit,r=0.3083,p=0.1524;pd-1,r=0.4749,p=0.0255)、cd8(tigit,r=0.6631,p=0.0003;pd-1,r=0.6652,p=0.0004),以及抑制性炎性细胞因子il-10(tigit,r=0.7938,p0.0001;pd-1,r=0.4980,p=0.0156)呈正相关性,tigit和pd-1也呈正相关性(r=0.7304,p0.0001)。第二部分,1.ae患者肝脏区域tigit和pd-1单独或协同性表达于cd4~+t和cd8~+t细胞表面,导致肝脏局部cd4~+t和cd8~+t细胞分泌效应分子granzymeb(cd8~+pd-1+vscd8~+pd-1-:8.00±3.03%vs32.0±8.32%,p0.05)、细胞因子ifn-γ(cd4~+tigit+vscd4~+tigit-:8.18±2.65%vs17.8±3.95%,p0.05)、细胞因子tnf-α(cd8~+tigit+vscd8~+tigit-:9.67±2.56%vs18.9±3.92%,p0.001;cd8~+pd-1+vscd8~+pd-1-:7.22±2.71%vs24.7±4.48%,p0.01)能力降低。2.ae患者肝脏病灶周围肝细胞为cd4~+t和cd8~+t细胞表面tigit提供配体cd155,巨噬细胞表面pd-1提供配体pd-l1。3.ae患者外周血cd8~+t细胞显著增加(p0.01),tigit和pd-1分子单独或协同性表达于cd4~+t和cd8~+t细胞表面(cd8~+tigit+tcells,hlvsae:34.3±2.40%vs48.9±2.62%,p0.001;cd8~+pd-1+tcells,hlvsae:18.6±1.39%vs23.3±1.64%,p0.05),其中pd-1阳性cd4~+t或cd8~+t细胞比例增加伴随ae患者血清中抗em2抗体水平增加(cd4~+pd-1+tcellss,em2,+vs++vs+++:3.41±0.70%vs6.91±1.00%vs6.91±1.00%,p0.05);ae患者外周tigit或pd-1阳性群t细胞与阴性群t细胞相比,其分泌granzymeb、perforin、ifn-γ和tnf-α能力降低,其中CD8+T细胞TIGIT阳性细胞群增殖能力显著下降(CD8+TIGIT+vs CD8+TIGIT-:38.7%vs 67.7%,P0.05);通过TIGIT抗体封闭,能够促进CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖。4.依据PET/CT影像学分组,高活跃型AE患者肝脏区域和外周血CD8+T细胞呈TIGIT和PD-1上调表达(肝脏,高vs低活跃型:TIGIT,31.7±9.09%vs26.4±11.0%;PD-1,19.8±8.57%vs 12.1±2.08%,P0.05.外周血,高vs低活跃型:51.6±14.7%vs 38.2±15.1%,P0.05;PD-1,22.1±11.7%vs 15.9±10.0%,P0.05)。第三部分,1.成功建立了E.m经肝门静脉感染小鼠模型,低和中剂量感染早期,肝脏局部形成T1型(CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+)和T17型细胞亚群优势,促进宿主对低中剂量E.m感染的清除;而高剂量感染晚期,肝脏局部形成以CD8+T细胞占优势炎症微环境‖,肝脏局部形成T2型和T17型细胞亚群优势,并且Treg型(CD4+IL-10+和CD8+IL-10+)细胞亚群比例趋于上调趋势,促进高剂量E.m感染在宿主肝脏的慢性寄生。2.高剂量E.m感染中晚期,诱导肝脏局部CD4+T细胞表面TIGIT和PD-1分子单独或协同性表达上调(P0.05或P0.001),CD8+T细胞表面TIGIT分子表达上调(24周,CD8+TIGIT+T cells,对照vs低vs周vs高剂量组:8.91±2.29%vs 12.3±1.45%vs 8.90±0.99%vs 15.5±2.15%,P0.05),其中TIGIT或PD-1阳性CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群分泌Granzyme B、CD107a、IFN-γ和TNF-α能力下降。3.不同剂量E.m感染中晚期,脾脏CD4+T细胞表面TIGIT和PD-1分子单独或协同性表达上调(24周,CD4+TIGIT+T cells,对照vs低vs周vs高剂量组:15.7±2.54%vs 28.8±2.10%vs 27.6±3.46%vs 28.0±2.82%,P0.05;CD4+PD-1+T cells,对照vs低vs周vs高剂量组:28.2±4.20%vs 42.6±2.59%vs 45.6±5.25%vs39.7±2.41%,P0.05),TIGIT或PD-1阳性CD4+T细胞分泌IFN-γ和TNF-α能力下降,TIGIT或PD-1阳性CD8+T细胞分泌Granzyme B、CD107a、IFN-γ和TNF-α能力下降。结论:1.AE患者肝脏区域存在“炎症微环境”,形成以CD8+T细胞浸润为主炎性细胞带,周围肝细胞提供配体CD155与TIGIT相互作用,巨噬细胞提供配体PD-L1与PD-1相互作用,可能以CD155-TIGIT和PD-L1-PD-1结合模式介导抑制性信号传递,导致肝脏局部T细胞功能降低,促进T细胞耗竭。2.高活跃型AE患者肝脏区域和外周血CD8+T细胞表面TIGIT和PD-1分子协同性上调表达,造成效应性T细胞功能下降,促进E.m活跃性或侵袭性生长。利用TIGIT抗体封闭,能够促进T细胞增殖能力。3.成功建立不同剂量E.m经肝门静脉感染小鼠模型;不同T1、T2、T17和Treg型亚群的免疫失衡,以及肝脏局部和脾脏T细胞表面TIGIT或PD-1分子表达上调,导致T细胞功能耗竭,造成高剂量E.m感染在宿主肝脏的慢性寄生,加重肝脏病理性损伤和纤维化程度。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R532.32

【共引文献】