HPA1促进胰腺癌侵袭和转移的分子机制研究

发布时间：2018-11-04 08:14

【摘要】：胰腺癌是最为致命的恶性肿瘤之一,其5年生存率不足5%。就目前来说,手术治疗是胰腺癌患者治愈的唯一机会,但是大多数胰腺癌患者在确诊时已经是局部晚期或者已经发生了远处转移,已经无法进行手术。另一些可以进行手术的患者,在术后也可能会发生复发或者转移。因此,寻找胰腺癌侵袭转移的生物标记和治疗靶点具有重要的意义。HPA1是哺乳动物中唯一能够切割细胞外基质中硫酸乙酰肝素侧链的内切性糖苷酶,肝素酶m RNA编码61.2k Da的肝素酶前体,随后被剪切形成以非共价键结合的8k Da和50k Da组成的具有酶活性的异源二聚体。HPA1在多种肿瘤中存在过表达的情况,且HPA1过表达的患者预后通常较差。HPA1可以降解细胞外基质和细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,促进细胞外基质的分解,促进肿瘤细胞的侵袭和转移。此外,HPA1可以释放硫酸乙酰肝素侧链所结合的一些生长因子和血管生长因子,促进肿瘤的生长和血管新生。一旦HPA1的活性被抑制,细胞中没有其他的酶来代替它行使功能,因此,HPA1是一个理想的治疗肿瘤的靶点。吉西他滨是一种阿糖胞苷类似物,是治疗胰腺癌的标准药物,可以单独或者联合其他药物用于胰腺癌的治疗。吉西他滨通过核苷转运蛋白进入细胞内,其代谢产物吉西他滨三磷酸盐可以抑制DNA聚合酶和胞嘧啶核苷三磷酸合成酶的活性,而且可以掺入到DNA中,使得DNA延长提前终止。尽管吉西他滨可以作用于肿瘤细胞的多个靶点,但是吉西他滨的治疗效果并不是很理想,而且肿瘤细胞还经常对吉西他滨产生耐药性。鉴于大多数胰腺癌患者对于吉西他滨反应不理想,而那些开始对吉西他滨敏感的患者最终可能产生耐药性,因此,在治疗胰腺癌领域急需有更好的药物能够取代吉西他滨或者提高吉西他滨的治疗效果。NF-κB是一种广泛存在的转录因子,在炎症反应和先天性免疫应答中发挥重要作用,同时可以被多种刺激所激活,包括一些生长因子、炎症因子、化疗药物等。NF-κB是由Rel家族的成员(p65/Rel A、c-Rel、Rel B、NFκB1/p50、NF-κB2/p52)组成的同源或者异源的二聚体,最常见的二聚体是由p65/Rel A和p50组成。NF-κB激活后,IκB磷酸化并释放Rel二聚体,随后Rel二聚体进入细胞核并激活相关目的基因的表达。在胰腺癌细胞中存在NF-κB信号通路持续激活的情况,这被认为和胰腺癌细胞的耐药密切相关,而且治疗胰腺癌的药物吉西他滨还可以激活NF-κB信号通路。此外,NF-κB还可以调控多个和肿瘤侵袭转移相关的基因。因此,NF-κB可以作为一个良好的治疗靶点联合其他的化疗药物一起使用。本课题组在前期研究中发现,HPA1在正常胰腺导管细胞中表达要低于胰腺癌组织,HPA1可以促进胰腺癌细胞的增殖和侵袭。但是,HPA1在胰腺癌临床中的诊断意义以及HPA1促进胰腺癌侵袭转移的机制尚不清楚。我们利用免疫组化在43例胰腺癌标本中检测了HPA1的表达,并分析了HPA1与胰腺癌患者的预后以及病理特征之间的关系。我们还发现了吉西他滨可以促进HPA1的表达,随后通过q RT-PCR,Western Blot,免疫荧光,染色质免疫共沉淀等方法研究了吉西他滨促进HPA1表达的分子机制,明确了NF-κB信号通路在HPA1表达调控中所发挥的作用。通过Transewell侵袭实验研究了HPA1在吉西他滨促进的胰腺癌细胞侵袭中所发挥的作用。主要的结论和结果:1.HPA1在胰腺癌细胞中的表达高于正常的胰腺导管细胞,HPA1主要定位于细胞浆中,且HPA1高表达的胰腺癌患者预后更差,其肿瘤的分化程度越低。62.8%(27/43)的胰腺癌患者的标本中HPA1呈高表达,HPA1与胰腺癌患者的肿瘤分化相关,但是与性别、肿瘤大小、TNM分期、远处转移和淋巴结转移无显著相关。HPA1在正常的胰腺导管中低表达,通过Kaplan-Meier生存分析表明HPA1高表达患者总体生存时间更短。2.HPA1的表达与p65呈正相关通过免疫组化染色,我们发现NF-κB的亚基p65的表达与HPA1的表达呈正相关(p=0.006),提示NF-κB信号通路可能参与HPA1的表达调控。3.HPA1主要定位于细胞浆中,且HPA1可以促进胰腺癌细胞的增殖和侵袭通过免疫荧光染色技术,我们发现HPA1主要定位在胰腺癌细胞的细胞浆中。通过CRISP/Cas9技术,我们构建了HPA1过表达的胰腺癌细胞系。在体外实验中,HPA1过表达显著促进胰腺癌细胞的侵袭和增殖,而使用si RNA敲低HPA1表达可以抑制胰腺癌细胞的侵袭;在体内实验中,HPA1过表达组形成的移植瘤要大于对照组,免疫组化染色也证实过表达HPA1组Ki-67阳性率更高。同时,过表达HPA1可以抑制上皮表型标记物E-cadherin的表达,促进间质型标记物Vimentin、Zeb-1、Snail的表达。4.HPA1可以通过促进EGFR的磷酸化,激活下游信号通路Western blot结果显示,过表达HPA1可以促进EGFR的磷酸化,随后促进src的磷酸化,激活下游的信号通路。5.吉西他滨通过NF-κB信号通路促进胰腺癌细胞HPA1的表达q RT-PCR结果显示,吉西他滨促进HPA1的表达呈时间和剂量的依赖性。在裸鼠皮下移植瘤实验中,腹腔注射吉西他滨后将移植瘤以q RT-PCR和免疫组化检测HPA1的表达,同样显示吉西他滨可以在体内促进HPA1的表达。为了研究吉西他滨促进HPA1的分子机制,我们使用了一系列信号通路抑制剂来预处理细胞,随后以吉西他滨处理。q RT-PCR和western blot结果表明,NF-κB的抑制剂可以抑制吉西他滨促进的HPA1表达。同时,吉西他滨能够促进p65转运至细胞核,而染色质免疫共沉淀实验显示p65可以结合到HPA1的启动子区域。6.HPA1抑制剂能够抑制吉西他滨促进的胰腺癌细胞侵袭吉西他滨处理可以促进胰腺癌细胞的侵袭,而加入HPA1的抑制剂可以抑制吉西他滨促进的胰腺癌细胞的侵袭,同样加入NF-κB的抑制剂也可以抑制吉西他滨促进的胰腺癌细胞的侵袭。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.9

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