青娥方含药血清对离体兔脊柱运节段压力退变模型的影响

发布时间：2018-11-10 15:40

【摘要】：研究背景椎间盘退变与下腰痛有很大的联系。祖国传统医学强调早期治疗与未病先防,对腰椎间盘退变等慢性病、难治病有其独特的优势,其中补肾活血法是治疗椎间盘退行性疾病的常用方法之一。基于腰椎间盘退变机理,并结合临床经验,以肾虚血瘀立法,根据古方青娥丸加减形成的青娥方,在临床治疗相关疾病中取得了较好的疗效。但目前该方的作用机理还不明晰,对该方的临床应用尚缺乏基础实验的支持,故有必要对其作用机制进行研究,为该方以及补肾活血法治疗椎间盘退行性疾病提供依据。然而中医药成分众多、作用复杂,再结合研究对象体内代谢及环境差异等因素,使我们难以全方位的深入探明其机制,如何排除多种因素的干扰,明确中医药对该类疾病的作用,是我们面临的挑战；同时为了更好的防治该类疾病,还需详细了解椎间盘的退变机理,其中生物力学与椎间盘退变关系密切,因此有必要探究生物力学与椎间盘之间的联系及作用,而构建理想的实验模型对研究椎间盘退变的发病机制和临床干预有着重要的意义。目前椎间盘退变模型主要分为体内模型和体外模型两大类,体外模型又分为离体培养的细胞和器官模型。将完整的椎间盘器官在体外进行整体培养,能够在可控的条件下研究椎间盘代谢和退变的相关机制,为观察椎间盘对外界刺激的反应和正常与退变椎间盘的组织学变化创造了良好的实验平台。在此基础上,相关研究离体培养了脊柱运动节段模型,包括整个椎间盘器官连同椎体,使模型一方面更接近体内环境,另一方面为加载装置提供了固定的施力处,为控制和研究生物力学对椎间盘的影响提供条件。本研究将脊柱运动节段与生物力学相结合,为观察生物力学与椎间盘的关系,以及研究中药防治椎间盘退变的机制提供更好的实验平台。研究目的：1.观察青娥方治疗椎间盘源性腰痛的临床疗效;2.比较离体培养的兔椎间盘器官及脊柱运动节段两种模型椎间盘髓核组织的变化,为研究生物力学对椎间盘的影响提供条件；3.建立离体兔脊柱运动节段压力退变模型,研究静态压力负荷对椎间盘的影响,并为进一步研究中药防治椎间盘退变提供条件；4.观察青娥方含药血清对离体兔脊柱运动节段压力退变模型的影响,初步探讨其作用机制,为补肾活血法治疗椎间盘退行性疾病提供依据。研究方法：1.对43例椎间盘源性腰痛患者使用青娥方治疗,日一剂,早晚口服,连续服用2周,于治疗前、治疗第1周、治疗第2周、疗程结束后1个月随访时进行VAS与ODI评分,观察临床症状,判定疗效；2.将21只新西兰白兔随机分为器官组8只,节段组13只,处死后在无菌条件下分别取出椎间盘器官和脊柱运动节段各50个,在高渗培养基中进行整体培养(410mOsm/kg),于培养前及培养后第3、7、14、21天,两组各取10个椎间盘分别进行HE染色、蛋白多糖特染、II型胶原免疫组化和髓核细胞活力测定。3.将14只新西兰白兔随机分为对照组与压力组各7只,处死后在无菌条件下分别取出脊柱运动节段各28个,对照组放入六孔板中,压力组放入脊柱运动节段离体加载和培养装置中,在高渗培养基中进行整体培养,两组培养液中均含有10%无药血清,于培养前及培养后第3、7、14天,两组各取7个椎间盘分别进行HE染色、蛋白多糖特染、II型胶原免疫组化和Real-time PCR检测。4.将14只新西兰白兔随机分为压力组与含药组各7只,处死后在无菌条件下分别取出脊柱运动节段各28个,均放入脊柱运动节段离体加载和培养装置中,在高渗培养基中进行整体培养,其中含药组与压力组培养液中分别含有10%青娥方含药血清与10%无药血清,于培养前及培养后第3、7、14天,两组各取7个椎间盘分别进行HE染色、蛋白多糖特染、I1型胶原免疫组化和Real-time PCR检测。研究结果：1.43例患者治疗第1周有效率为86.04%,治疗第2周及随访时有效率为90.69%；治疗第1周、第2周与随访时的VAS及ODI评分均与治疗前有明显差异(P0.001),治疗第2周、随访时的VAS及ODI评分与治疗第1周也有差异(P0.05),但治疗第2周与随访时的VAS及ODI评分差异无统计意义(P0.05);2.培养21d器官组与培养14d节段组HE示椎间盘组织结构基本保持完整,21d节段组椎间盘组织形态学破坏；蛋白多糖PAS/AB染色7d内两组强度无降低,14d两组强度均有所减弱,21d节段组染色强度进一步减弱,改变比器官组更为明显；21d器官组与14d节段组Ⅱ型胶原免疫组化染色强度无显著差异(P0-05),21d节段组染色变浅,与之前各时间点及器官组相比有显著差异(P0.05);髓核细胞荧光检测两组7d时强度较培养前变化不明显(P0.05),21d器官组与14d节段组强度略有降低,但与之前时间点比较无显著差异(P0.05),21d节段组髓核细胞荧光强度减弱,细胞活性降低,与之前各时间点及器官组比较差异明显(P0.05)。3.对照组培养至14d形态基本维持良好,压力组3d后形态完整性逐渐被破坏；蛋白多糖含量对照组7d时降低,压力组3d时就显著降低,并且分布不均匀；Ⅱ型胶原含量对照组始终较稳定无明显变化(P0.05),压力组3d时出现明显升高,与培养前及对照组相比差异显著(P0.05),7d时又明显降低,与对照组相比差异显著(P0.05),14d时与7d无明显差异(P0.05),与对照组差异显著(P0.01);Real time-PCR检测Agg的基因表达显示,与培养前比对照组3d时无明显变化(P0.05),7d与14d降低与培养前相比有明显差异(P0.05),压力组3d时便显著下降(P0.05),7d与14d进一步下降,与对照组差异明显(P0.01);COL2a1的基因表达显示对照组较培养前表达下降(P0.05),但培养期间表达水平较稳定(P0.05),而压力组3d时表达上调(P0.05),与对照组比有显著差异(P0.01),7d时表达又明显下调(P0.05),与培养前及对照组相比差异显著(P0.05),14d与7d相比差别无统计学意义(P0.05),但与对照组比有明显差异(P0.01)。4.压力组3d后形态完整性逐渐被破坏,含药组培养至7d形态基本维持良好,14d时形态破坏与压力组相似；蛋白多糖含量压力组3d时就显著降低,7d后下降更明显,且分布不均匀,含药组3d时着色强度部分减弱,7d与14d也均明显减弱,提示蛋白多糖含量减少；Ⅱ型胶原含量压力组与含药组3d时均出现明显升高(P0.05),且含药组更加显著(P0.05),7d时又均明显降低(P0.05),但含药组仍比压力组含量高(P0.05),14d两组则反应均较弱无明显差异(P0.05);Real time-PCR检测Agg的基因表达显示,与培养前比两组3d时便显著下降(P0.05),但与压力组相比含药组表达明显(P0.01),7d与14d表达进一步下降(P0.05),两组之间无明显差异(P0.05);COL2a1的基因表达显示两组3d时表达上调(P0.05),且含药组更加显著(P0.01),7d后均明显下降(P0.05),但含药组仍比压力组表达水平高(P0.05),14d两组表达水平均较低无明显差异(P0.05)。结论青娥方能有效改善肾虚血瘀型椎间盘源性腰痛患者的临床症状与功能活动,随访期疗效稳定；离体兔脊柱运动节段可在短周期内(14d)作为研究生物力学对椎间盘影响的离体实验模型；建立了一个针对离体兔脊柱运动节段的压力退变模型,该模型可作为研究生物力学与椎间盘退变的相关性,以及中药防治椎间盘退变机制的离体实验模型;青娥方含药血清短期内(7d)能一定程度上延缓椎间盘退变,为补肾活血法对椎间盘退变的早期防治作用提供了依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285.5

【参考文献】