基于肠癌PDX模型血管靶向药物抗肿瘤个体化治疗研究

发布时间：2018-11-25 07:33

【摘要】：背景:结直肠癌位列全球恶性肿瘤相关死亡率的第四位。诊治技术和新药研发的不断进步,将结直肠癌带入精准化、个体化靶向治疗的时代。然而,近年来发现,并不是所有的病人都能够从目前已有的靶向药物获益,因此更多的分子靶点和标志物有待发现,更多的靶向新药有待研发,更加精准化、个体化的治疗手段有待探索。病人来源移植瘤(patient-derived xenograft,PDX)模型逐渐广泛地被应用于多种癌症的转化研究。PDX移植瘤模型通过将病人的肿瘤组织直接接种于免疫缺陷裸鼠而建成。已有大量的证据表明,PDX移植瘤模型保留了原肿瘤的组织病理学特征和生长方式特点,有良好的"仿真度"和准确的临床疗效预测能力,可以成为药物敏感性预测、新药临床前试验、药物耐药机制研究以及验证科研假说等方面成为重要的研究平台。高通量组学技术(Omics technology),以其高输出量与高解析度的特性,可以成为探索抗肿瘤药效反应机制、筛选预测标志物、寻找耐药解决方案的重要工具。多维度组学技术的结合,可以更为全面、可靠地寻找与临床表型相对应的分子标记。过去几年的临床试验表明血管靶向药物抗肿瘤能带来一定的临床获益。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达贯穿于恶性肿瘤整个生长周期,因此VEGF是研发抗肿瘤血管生成药物的理想靶点。VEGF靶向药物已经被证实在多种肿瘤的治疗中具有较好的抑制新生血管生成的作用,然而仍然面临原发或继发耐药的问题。目前血管靶向药物经证实有效的药效预测生物标志物的缺乏成为精准用药的最大障碍和瓶颈,因此寻找血管靶向药物的敏感性预测生物标志物成为迫切的需要。另外,如何解决血管靶向药物原发或继发耐药成为一个重大的挑战,对血管靶向药物的耐药机制的深入研究成为迫切需要。血管靶向药物联合化疗药的抗肿瘤协同作用的机制是血管靶向药物具有使肿瘤血管正常化作用从而促进了化疗药物运输到达肿瘤内部组织,血管正常化水平愈高则协同作用愈强,而血管正常化的时间窗是由血管靶向药物的剂量和用药时间决定的,因此血管正常化的监测分子标志物可以有助于更加合理调整血管靶向药物联合化疗药物的剂量和用法。血管生成素1(Ang-1)以及与之天然对抗的血管生成素2(Ang-2)是血管成熟化、维持和重塑血管结构的最重要的生长因子;Ang-1主要由外膜细胞(还有血管平滑肌细胞和肿瘤细胞)分泌,Ang-2主要由内皮细胞表达。肿瘤血管正常化是血管生成促进和抑制之间的不平衡状态得到纠正时出现的,而正常化血管由较多外膜细胞覆盖。因此,Ang-1/Ang-2比值可以在某种程度上反映这种动态平衡以及血管外膜细胞的覆盖程度,是具有潜力的血管正常化监测标志物,在血管靶向药物联合化疗药药效中具有一定的预测价值。FP3(康弘药业KH903)是我国自主研发的一种以VEGF为靶点的全人源化的可溶性受体蛋白,是将VEGFR1的第二个胞外区域以及VEGFR2的第三、四个胞外区域与人免疫球蛋白1(IgG1)Fc片段基因融合从而构建的融合蛋白。近期FP3作为眼科药物已在美国直接开展Ⅲ期临床试验,另外,研究亦发现FP3具有一定的抗肿瘤血管生成和抑制肿瘤增殖的作用。本论文目标是基于肠癌PDX模型筛选和验证新型血管靶向药物FP3抗肿瘤治疗的药效预测标志物,为血管靶向药物抗肿瘤个体化治疗提供研究基础。第一部分:目的:本部分研究的目的是建立结直肠癌患者新鲜肿瘤组织来源的裸鼠PDX移植瘤模型以作为药效评估体系。方法:85例结直肠癌患者新鲜肿瘤组织接种于裸鼠皮下用于建立PDX移植瘤模型。HE染色、免疫组织化学染色、50肿瘤相关热点突变基因二代测序panel以及NANO-LC/MS/MS蛋白质液相二级质谱检测等方法用于初步鉴定PDX模型与临床肿瘤组织遗传分子特征的符合率以及在传代过程中的生物学稳定性。结果:成功建立了结直肠癌患者PDX移植瘤模型50例(成功率58.8%),通过HE染色,CEA、CK7、ki67、VEGF、FGFR2和VEGFR2的免疫组织化学染色对比,以及50肿瘤相关热点突变基因二代测序pane1和NANO-LC/MS/MS蛋白质液相二级质谱检测等都表明,结直肠癌PDX移植瘤组织与患者来源肿瘤组织在组织形态、基因突变状态和蛋白表达等方面都显示出与患者新鲜肿瘤组织高度的一致性。结论:本研究成功建立具有较高临床仿真度的结直肠癌患者PDX模型,可以成为较好的抗肿瘤药物评价体系。第二部分:目的:本部分研究基于结直肠癌PDX模型初步评估抗血管靶向新药FP3单药及与化疗药联合药效。方法:挑选1例第三代结直肠癌PDX模型,传代后分为6组:(1)生理盐水对照组;(2)FP3 组(20mg/kg iv qw);(3)贝伐单抗组(20mg/kg iv qw);(4)盐酸伊利替康(CPT-11,5mg/kg ip qw)组;(5)FP3(20mg/kg iv qw)联合盐酸伊利替康(5mg/kg ip qw)组;(6)贝伐单抗(20mg/kg iv qw)联合盐酸伊利替康(5mg/kg ip qw)组。然后通过血管免疫荧光观察CD31标记的血管内皮细胞受抑制情况,以及通过免疫组化观察用药后增殖相关抗原ki67的表达变化;另外通过CD31标记血管内皮细胞、α-SMA标记血管外膜细胞,分别观察FP3单药和联合化疗药作用后肿瘤血管的正常化作用。结果:FP3组与贝伐单抗组有相近的RTI(相对肿瘤抑制率);FP3联合CPT-11组与贝伐单抗联合CPT-11组有相近的RTI。联合用药组RTI均高于单药组。FP3用药后CD31的免疫荧光表达下降,ki67组化表达下降。FP3联合CPT-11下调ki67更明显,而CD31下调程度与单药作用相近。通过CD31、α-SMA标记免疫荧光观察,FP3单药或联合化疗药作用后,肿瘤血管均发现血管正常化作用。结论:FP3单药可以有效抑制肠癌血管生长,从而抑制肿瘤生长;FP3联合CPT-11抑制血管生长方面与单药FP3相近,抑制肿瘤生长方面具有显著的协同作用;FP3单药和联合化疗药疗效与BEV相近;FP3作为单药和联合CPT-11用药作用后都促进肿瘤血管正常化。第三部分:目的:本部分研究基于结直肠癌PDX模型和高通量组学技术筛选和验证FP3单药药效敏感性预测生物标志物。方法:评估FP3单药高浓度剂量(60mg/kg iv qw)对20例结直肠癌PDX模型的抗血管作用并将各用药模型区分为FP3敏感组和不敏感组,进而以多维度高通量组学技术对比检测差异分子以筛选可能的FP3药效预测生物标志物并初步验证标志物的有效性。结果:评估了 FP3对20例结直肠癌PDX模型的抗血管作用并将模型区分为FP3敏感组和不敏感组,进而以50肿瘤相关热点突变基因panel二代测序、转录组测序以及NANO-LC/MS/MS蛋白质液相二级质谱检测等3个不同层面的高通量组学检测以分别检测FP3药效敏感组和耐药组之间差异DNA、RNA和蛋白质,通过生物信息学及文献检索发现3个层面的高通量组学检测结果在HIF-1α(缺氧诱导因子1α)蛋白表达调控通路上交叠。将此20例模型肿瘤组织检测HIF-1α免疫组化蛋白表达,发现高表达组和低表达组有显著的FP3药效差异。FP3联合HIF-1α抑制剂对单药最不敏感的模型C70(KRAS突变型,HIF-1α高表达)具有显著的协同作用。血管免疫荧光发现FP3联合HIF-1α抑制剂后可以显著降低新生血管密度,另外免疫组化结果显示HIF-1α抑制剂能显著抑制HIF-1α的表达,HIF-1α抑制剂联合FP3能够显著下调ki-67的表达。进一步,FP3组和HIF-1α抑制剂联合FP3组进行了重复实验,Western blot结果发现FP3单药作用于C70第1天VEGF表达下调而第6天表达反跳,联合HIF-1α抑制剂后VEGF可以被持续抑制。结论:研究结果初步确定HIF-1α及相关通路可能为FP3的药效预测标志物;HIF-1α的高表达促进VEGF持续表达可能是FP3的耐药的原因之一,FP3联合HIF-1α抑制剂有潜力成为HIF-1α高表达导致FP3耐药的逆转治疗,有待进一步大样本验证和机制研究。第四部分:目的:本部分研究为了初步探究Ang-1/Ang-2在FP3联合化疗药药效中的预测价值。方法:挑选FP3单药评估耐药的结直肠癌PDX移植瘤模型,评估FP3不同剂量浓度(7.5、15、30、60mg/kg iv qw)联合相同剂量浓度(5mg/kg ip qw)化疗药盐酸伊立替康(CPT-11)药效,并分别取第0、7、14、21和28天的血清做ELISA检测Ang-1/Ang-2比值,从Ang-1/Ang-2比值与不同剂量浓度药效的对应关系来验证Ang-1/Ang-2比值作为血管正常化水平监测标志物的可靠性。结果:FP3在15mg/kg剂量浓度时联合CPT-11表现出最佳协同作用,通过血清ELISA检测发现:15和7.5mg/kg FP3联合CPT-11治疗后血清Ang-1/Ang-2比值都维持在缓慢的升高。15mg/kg FP3联合CPT-11治疗后血清Ang-1/Ang-2比值较7.5mg/kg高。30和60mg/kg FP3联合CPT-11治疗后血清Ang-1/Ang-2比值迅速升高。结论:Ang-1/Ang-2比值可以提示血管正常化水平,对FP3联合化疗药药效具有一定的预测价值。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.34

【参考文献】