PRDM14对非小细胞肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响及作用机制研究

发布时间：2018-12-11 06:15

【摘要】：PRDM14 是 PRDM(PRDI-BF1 and RIZ homologous domain-containing proteins)家族中的一员,是一种重要的转录因子。其所具有的PR(PRDI-BF1 and RIZ homologous)结构域、锌指结构以及SET(Su(var)3-9 enhancer-of-zeste and trithorax)结构域蛋白含有的组蛋白甲基转移酶活性使得PRDM14可以直接参与蛋白质间的互作或实现下游基因的表达调控。大量研究表明,PRDM14除了在哺乳动物原始生殖细胞特化、干细胞多能性维持和染色体表观重编程等过程中发挥着重要的作用以外,还参与调控细胞分化、生长与凋亡,并且是多种癌症的易感基因位点。但是现有研究对PRDM14参与癌症发生发展的作用机制和影响肿瘤细胞耐药性方面的讨论较少。有研究表明,非小细胞肺癌患者中PRDM14所在染色体上的区段有高频的基因拷贝数改变现象,且PRDM14在非小细胞肺癌组织中的表达水平高于癌旁正常组织,这些提示我们该蛋白参与了非小细胞肺癌的发生发展过程。本研究利用慢病毒载体系统和CRISPR-Cas9系统分别构建了过表达PRDM14和敲低PRDM14的非小细胞肺癌A549细胞系,通过cell counting kit(CCK8)检测细胞活力,细胞计数实验和细胞克隆形成实验检测细胞增殖情况,发现在体外细胞水平,PRDM14可以促进A549细胞的增殖。利用BALB/c Nude免疫缺陷型裸鼠进行体内实验证明,PRDM14在体内对A549细胞增殖同样具有促进效应。为了进一步了解PRDM14促进A549细胞增殖的作用机制,本研究首先通过流式细胞术分析了 PRDM14异常表达对细胞周期的影响。结果表明过表达PRDM14可以加快A549细胞周期进程;而干扰PRDM14的表达,将使A549细胞G2/M期转换受到阻滞,阻碍了细胞周期。随后实时荧光定量PCR的结果表明,PRDM14可以通过影响细胞周期蛋白cyclin B1、cyclinD1、cyclin E1,细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4、CDK6和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制子p21 mRNA水平的表达,进而调控A549细胞的细胞周期进程。为探究PRDM14是否对肿瘤的转移和浸润等生物学特点有影响,本研究通过伤口愈合实验和细胞小室实验发现过表达PRDM14可以显著增强A549细胞的迁移能力和侵袭能力。实时荧光定量PCR结果表明,PRDM14依赖于增加MMP/TIMP(细胞基质金属蛋白酶/细胞基质金属蛋白酶组织抑制物)的表达比例,特别是MMP2/TIMP2比例,来提高A549细胞的迁移能力。为了了解PRDM14在细胞耐药过程中的作用,本研究将紫杉醇(Taxol)、长春地辛(VDS)、长春新碱(VCR)和顺铂类药物(DDP)四种药物分别浓度梯度处理PRDM14表达水平不同的各组细胞,利用CCK8和流式细胞术方法分析细胞活力和凋亡细胞比例的变化。结果表明,PRDM14可以抑制药物诱导的细胞凋亡并降低A549细胞对化疗药物的敏感性。为了进一步探究PRDM14参与细胞增殖和凋亡的相关机制,本研究利用western blot方法检测了大量肺癌相关通路上蛋白表达水平的变化。结果表明,过表达PRDM14显著促进了 p38 MAP激酶的磷酸化,增强了 NF-κB的活化并下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制子p27的表达。有趣的是,过表达PRDM14也上调了肿瘤抑制蛋白p53的表达。以上实验结果表明,PRDM14的高表达可以促进A549细胞的增殖、迁移及侵袭能力,并通过调控细胞周期相关因子的表达影响细胞周期进程。PRDM14可以通过调控p38 MAPK信号通路抑制药物刺激诱导的细胞凋亡,从而减弱A549细胞对化疗药物的敏感性。这些发现为进一步了解PRDM14的生物学功能及其对肺癌细胞增殖和凋亡调控机制的研究提供了理论依据,为PRDM14可以作为肺癌治疗的靶基因这一预测提供了新的实验证据。
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【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

【参考文献】