【摘要】：目的:1、体外培养人晶状体上皮细胞株HLEB-3,观察TGF-β32对晶状体上皮细胞的移行和转分化的影响。2、观察不同浓度的NF-K B p65 ASODN和不同剂量的转染剂HiPerFect对晶状体上皮细胞的影响。3、通过应用NF-K B p65 ASODN在体外转染人晶状体上皮细胞,检测其对由TGF-β32诱导的晶状体上皮细胞的移行和转分化的影响,研究NF-K Bp65AS0DN在体外对晶状体上皮细胞的影响。4、采用眼前房内注射法转移NF-K Bp65AS0DN至新西兰大白兔后发性白内障模型眼内,观察其对后发性白内障的作用,探讨后发性白内障的基因治疗方法。材料和方法:1、体外培养人晶状体上皮细胞株HLEB-3,用不同浓度的TGF-β2处理后,在不同的时间点用细胞划痕法观察细胞的移行能力,ELISA法处理细胞爬片后,检测细胞爬片中的阳性细胞数和吸光度值,检测α-SMA蛋白的变化。2、将NF-K B p65 ASODN行全程硫代磷酸化修饰,不同浓度的NF-K B p65 ASODN和不同剂量的转染剂HiPerFect两两混合,探讨细胞活性不受明显影响的情况下,最佳的转染效率时所需的NF-K B p65 ASODN的浓度和转染剂的剂量。3、细胞同步培养后分五组:(1)空白对照组(单纯FSM培养),(2)阴性对照组(HiPerFect转染试加入到FSM中共同培养),(3)TGF-β 2组(T组)(10ng/ml TGF-β2) , (4)TGF-β2 加 ASODN 组(T+A 组)(TGF-β2、HiPerFect 转染试和AS0DN加入到FSM中共同培养),(5)TGF-β 2加MS0DN组(T+M组)(TGF-β32、HiPerFect转染试和MS0DN加入到FSM中共同培养)。不同组细胞继续培养,6h、12h、24h、48h四个不同时间点收集上清液检测α-SMA的含量,采用RT-PCR检测细胞NF-K B mRNA的表达情况。4、将16只新西兰大白兔进行晶状体囊外摘除术制作后发障活体眼动物模型,手术后随即分为四组,每组4只。A组:空白对照组4只白兔8眼:术毕经侧切口向前房注射BSS液100ul; B组:阴性对照组4只白兔8眼:术毕经侧切口向前房注射含3ul HiPerFect的BSS液100ul; C组:AS0DN —次注射组4只白兔8眼:术毕经侧切口向前房注射含3ul HiPerFect和10mol / L的NF-K B p65 AS0DN的BSS液100ul; D组:AS0DN两次注射组4只白兔8眼:术毕和术后第2天分别经侧切口向前房注射含3ul HiPerFect和10mol / L的NF-K Bp65 AS0DN的BSS液100ul。术后第7、14、21、28天用超声角膜测厚仪测量中央角膜厚度,用裂隙灯显微镜观察前房炎症反应和后囊膜的混浊情况,并于实验结束时行HE染色观察后囊膜的病理变化、检测α -SMA的表达和进行RT-PCR检测晶状体上皮细胞中NF-K B p65 mRNA的表达。结果:1、TGF-β 2是晶状体上皮细胞重要的促移行和转分化生长因子,其作用呈现明显的浓度和时间依赖性。不同浓度的TGF-β 2作用48h后,移行距离随着TGF-β2浓度的增加而增加,当浓度为1Ong/ml时作用最强;晶状体上皮细胞在10ng/mlTGF-β2作用下,其移行距离随着作用时间的延长而增加,在48h达到高峰。晶状体上皮细胞在TGF-β2作用下由单层立方形变为长梭形,伸出伪足,逐渐呈现纤维细胞样形态。不同浓度的TGF-β 2作用48h后,细胞爬片中α -SMA的阳性细胞数和吸光度值随着TGF-β 2浓度的增加而增加,当浓度为1Ong/ml时数值最大;晶状体上皮细胞在1Ong/ml TGF-β 2作用下,细胞爬片中α-SMA的阳性细胞数和吸光度值随着作用时间的延长而增加,在48h达到最大值。2、NF-K B p65 AS0DN对HLE B-3细胞的导入率随时间的延长而增加,48h导入率可达60%以上,并且细胞的活性不受影响;随着浓度增加,NF-KBp65AS0DN对HLE B-3细胞的导入率增加,10μ g/ml的转染率最高,再增加浓度转染率增加不明显,对细胞活性影响不明显;当剂量≤3ul时,随着转染剂HiPerFect的增加,对细胞的转染率增加,无明显细胞毒性,当剂量增加为4u时,对细胞的转染率增加不明显,并且表现出细胞毒性。HiPerFect的剂量为3ul,AS0DN的浓度为1Onmol / L对细胞存活率影响小(80. 4%),同时细胞的转染率可高达70. 8%,为最理想转染条件。3、在6h、12h、24h、48h四个不同时间点与空白对照组相比,阴性对照组、T组、T+A组、T+M组上清液α -SMA的浓度显著增加,差异有显著统计学意义(P0.01);与阴性对照组相比,T组、T+M组上清液α-SMA的浓度显著增加,差异有显著统计学意义(P 0. 01);与阴性对照组相比,T+A组上清液α -SMA的浓度增加不明显,差异无统计学意义(P0.05);与T+A组相比,T组、T+M组上清液α-SMA的浓度显著增加,差异有显著统计学意义(P 0.01) : T组与T+M组上清液α -SMA的浓度之间的差异不明显,差异无统计学意义(P0. 05)。NF-K B p65 mRNA出现在364 bp处。6h、12h、24h、48h四个不同时间点与空白对照组相比,阴性对照组、T组、T+A组、T+M组NF-K B p65 mRNA的含量显著增加,差异有显著统计学意义(P 0.01);与阴性对照组相比,T组、T+M组NF-K B p65 mRNA的含量显著增加,差异有显著统计学意义(P 0.01);与阴性对照组相比,T+A组NF-KBp65mRNA的含量增加不明显,差异无统计学意义(P0.05);与T+A组相比,T组、T+M组NF-K Bp65mRNA的含量显著增加,差异有显著统计学意义(P 0. 01) ; T组与T+M组NF-K B p65 mRNA的含量之间的差异不明显,差异无统计学意义(P0.05)。4、眼前节炎症反应均在一周内消失,组间无统计学差异。术后1周左右,A、B组开始出现后囊膜混浊,随时间延长而逐渐加重,C、D组后囊混浊发生时间均迟于A、B组,混浊程度也较A、B组为轻,差异有显著统计学意义(P 0. 05)。C、D组之间差异无统计学意义。HE染色后观察到A、B组后囊表面可见多层成纤维细胞生长,细胞排列较为紧密,囊袋周边部皮质增生,同时可见明显纤维素样物质沉积,C、D组后囊表面相对干净,仅有少量细胞增殖,细胞排列较为疏松。A、B组后囊膜α-SMA的表达量较C、D组明显增加,差异有显著统计学意义;A组和B组之间,C组和D组之间差异不明显,无统计学意义。RT-PCR分析结果发现A、B组NF-KBp65mRNA的表达量较C、D组明显增加,差异有显著统计学意义;A组和B组之间,C组和D组之间差异不明显,无统计学意义。结论:1、TGF-β 2可促进晶状体上皮细胞的移行,同时反应细胞间质转分化的α -SMA蛋白的表达增加,应用TGF-β 2刺激体外培养的晶状体上皮细胞可成功建立后发障的细胞模型。2、HiPerFect的剂量为3ul, ASODN的浓度为10nmol / L对细胞存活率影响小(80.4%),同时细胞的转染率可高达70. 8%,为最理想转染条件。3、NF-K B p65 AS0DN可特异性阻断NF-K B p65 mRNA的表达,抑制TGF-β 2诱导的α -SMA的表达和晶状体上皮细胞出现移行和间质转分化。4、采用眼前房内注射法转移NF-K Bp65AS0DN可抑制新西兰大白兔后发性白内障模型眼内后囊膜上α -SMA的表达和NF-K B p65 mRNA的表达,抑制后囊膜的混浊,并且不增加炎症反应和对角膜的影响。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R77
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本文编号：
2423475
