基于单克隆抗体特异性敲除技术的栀子苷与栀子改善HUVEC细胞氧化应激损伤作用的相关性研究

发布时间：2019-02-19 08:37

【摘要】：目的通过制备栀子苷单克隆抗体免疫亲和色谱柱,实现对栀子提取液中的栀子苷进行特异性敲除,探讨桅子苷与栀子在内皮细胞氧化应激损伤保护作用方面的相关性。1.合成栀子苷人工抗原,制备栀子苷单克隆抗体,纯化单克隆抗体蛋白。2.利用栀子苷单克隆抗体建立栀子苷酶联免疫分析法,考察该方法的精密度、加样回收率,并进行复方中栀子苷含量的测定。3.制备栀子苷单克隆抗体免疫亲和色谱柱,优化色谱柱的工作条件,实现对栀子提取液中栀子苷的特异性敲除。4.探讨栀子苷及不同栀子苷含量的栀子提取液对H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)氧化应激损伤保护作用的药效关联性,分析栀子苷对栀子的药效影响。方法1.选用高碘酸钠氧化法合成栀子苷人工抗原,动物免疫后检测血清抗体,进行脾细胞与骨髓瘤细胞的融合,筛选阳性杂交瘤细胞,单克隆化培养后,腹水诱导法量产抗体,辛酸法纯化抗体蛋白,对纯化后抗体进行效价和特异性检测。2.棋盘法检测包被原和一抗的最佳工作浓度,建立栀子苷单克隆抗体的酶联免疫分析法,考察该方法的精密度和加样回收率,与HPLC法检测结果进行相关性分析,检测不同配伍含栀子处方中的栀子苷含量。3.利用纯化后的栀子苷单克隆抗体,将其偶联到活化后的琼脂糖凝胶上,制备栀子苷单克隆抗体免疫亲和色谱柱,优化筛选孵育时间、敲除缓冲液和洗脱缓冲液及各缓冲液的流速,考察色谱柱的偶联率、柱容量,建立对栀子提取液中栀子苷敲除样品的液相图谱,具体条件如下:安捷伦 1260 infinity,Agilent ZORBAX-C18 柱,柱温 30℃,1ml/min流速,10μl/针进样量,流动相0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(C),梯度条件0-37min,95%(A)_5%(C);37-60min,85%(A)_15%(C);60-65min,70%(A)_30%(C);65-70min,95%(A)_5%(C)。4.以H202诱导的HUVEC氧化应激损伤模型为载体,通过特异性敲除及定量回填栀子苷的方法,进行栀子苷及不同桅子苷含量的栀子提取液对H202诱导的HUVEC氧化应激损伤细胞活力及NO、NOS、SOD、GSH-px等氧化应激相关指标的药效关联研究。结果1.栀子苷人工抗原合成成功,经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)检测并计算得出栀子苷与BSA的偶联比约为34:1.经细胞融合筛选成功制备了能分泌栀子苷单克隆抗体的杂交瘤细胞株,SDS-PAGE结果显示经纯化除去了腹水中的大量杂蛋白,获得了较高纯度的栀子单克隆抗体,纯化前后腹水中的抗体效价均为1:60000左右。抗抗体与其结构类似物、桅子中其他主要药物成分、常配伍的中药化合物均无明显交叉反应,具有良好的特异性。2.建立了该栀子苷单克隆抗体的酶联免疫分析法,线性检测范围大致是1μg/mL-50μg/mL,线性回归方程为 Y=-0.158ln(x)+0.9392,R2=0.9912。IC50 值(即半数抑制浓度)为6.115μg/mL,最低检测限约为258 ng/mL。检测结果与HPLC法的检测结果相关性好,R2=0.9982。该方法的板内差变异系数和板间差变异系数均在15%以内,平均加样回收率为101.51%,符合生物样品检测的需求。3.制备了栀子苷单克隆抗体免疫亲和色谱柱,确定以去离子水作为敲除缓冲液,孵育时间设定为60min,敲除液流速为1ml/min,0.1M的甘氨酸-盐酸缓冲液作为洗脱液,洗脱液流速为2ml/min的反应体系作为该栀子苷免疫亲和色谱柱的最适工作条件。抗体蛋白偶联率为87.3%,抗体蛋白与柱体的偶联比为5.74mg/ml,柱体的容量约为3.25μg/ml。成功建立了栀子苷的敲除方法,制备了特异性敲除栀子苷的栀子提取液样品。4.通过500μmol/l H202诱导HUVEC 12h建立氧化应激损伤模型,以栀子苷及含有50%、100%、150%、200%栀子苷的栀子提取液分别干预。结果显示,氧化应激损伤使HUVEC细胞存活率下降至54.037%,细胞培养基中NO含量由36.97pmol/l降至19.86μmol/l,细胞的 NOS、SOD、GSH-px 活性分别由 3.07U/mgprot、37.48U/mgprot、217.40U/mgprot 降至 1.39U/mgprot、23.18U/mgprot、110.87U/mgprot。较之 H2O2模型组,栀子苷以及50%、100%、150%、200%栀子苷含量的栀子提取液均能不同程度地提高细胞存活率,增加培养基中NO含量及NOS、SOD、GSH-px活性,差异有统计学意义(P0.05)。并且在50%、100%、150%栀子苷三组中,随着栀子苷含量的升高,细胞存活率不同程度升高,NO含量及NOS、SOD、GSH-px活性不同程度增加,差异有统计学意义(P0.05)。虽然50%栀子苷组的NOS和SOD活性较100%栀子苷组无明显统计学差异(P0.05),但数值上活性有下降趋势。200%栀子苷组的细胞存活率、NO含量及NOS活性与150%栀子苷组相比没有明显统计学差异(P0.05),SOD及GSH-px活性较150%栀子苷组明显下降(P0.05),继续增加栀子苷含量不能进一步提高氧化应激的保护作用。结论本研究制备的栀子苷单克隆抗体具有较强的特异性与亲和力,基于该单克隆抗体建立的酶联免疫分析法在检测结果上与传统高效液相法的检测结果相关性良好,可以用于相关样品中栀子苷的含量测定。在此基础上制备的栀子苷单克隆抗体免疫亲和色谱柱,能够实现栀子提取液中栀子苷成分的特异性敲除。进一步的药效关联性研究结果显示,栀子苷及不同栀子苷含量的栀子提取液对内皮细胞氧化应激损伤都有不同程度的保护作用,且随着栀子苷含量的增多,氧化应激保护作用有不同程度的增强,表明栀子苷与栀子在内皮细胞氧化应激保护作用上存在一定的药效关联性,对栀子的药效发挥有重要影响。
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【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

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