Notch调节炎症小体NLRP3活化在APAP药物性肝损害中作用和机制研究

发布时间：2019-04-29 11:21

【摘要】：目的:临床中,过量摄入对乙酰氨基酚类药物是引起严重肝损的主要原因之一,甚至会导致急性肝衰。对乙酰氨基酚诱导的肝损不仅和药物用量以及初始肝细胞损伤程度相关,也与炎症反应相关。在药物性肝损害发展过程中,肝内巨噬细胞和中性粒细胞均存在不同程度的激活。在人体中,固有免疫是抵御病原体攻击的第一道屏障。其主要与PRRs家族的功能相关。PRRs受体通过识别PAMPs或者DAMPs启动炎症反应信号通路。在PRRs家族中,TLRs受体是最先被发现并且深入研究的。TLRs主要存在于巨噬细胞的中性粒细胞表面,其激活可以导致巨噬细胞和中性粒细胞分泌炎症因子。Notch信号通路是一种进化非常保守的信号通路,其在细胞生长、分化和再生中发挥着重要的作用。Notch信号通路可以调节细胞的分化、增殖、存活和发育。在免疫系统中,Notch信号通路调节多种固有免疫细胞的活性及其功能。在肝脏再生过程中,激活Notch1及其配体Jagged1可以促进细胞的生长和分化。而抑制Notch信号通路可导致更加严重的肝脏损伤。NLRP3炎症小体是NLR家族中胞内识别受体的一种,其可以被损伤细胞释放的PAMPs和DAMPs激活。NLRP3通过活化caspase-1诱导IL-1β的成熟和释放,从而调节免疫功能。目前,在对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损害中Notch信号通路的调节功能目前尚不清楚。本课题通过研究Notch信号通路在对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损害过程中对固有免疫免疫功能的调节和机制,阐述Notch信号通路在药物性肝损害发展中的作用。方法:1.通过在野生型老鼠(WT)和TLR4基因敲除老鼠腹腔中注射对乙酰氨基酚或者PBS,我们制造了对乙酰氨基酚诱导药物性肝损害的动物模型。2.小鼠同时接受DAPT,Notch信号通路的抑制剂或者DMSO作为对照。收集24小时血清标本检测ALT,应用Western Blot的方法检测Hes1、HMGB1、TLR4、NF-κB和NLRP3的表达以及TUNEL检测细胞凋亡。3.在体外实验部分,骨髓来源巨噬细胞(BMMs)从小鼠中提取培养后并转染Notch1 siRNA,TLR4 siRNA和空白对照siRNA,然后通过LPS诱导刺激后进行相关检测。结果:1.抑制Notch信号通路加重了 APAP药物性肝损伤对乙酰氨基酚处理24h后,DAPT处理组小鼠的血清ALT为12443±872 IU/L,与对照组8621±322 IU/L相比,具有统计学差异(P0.01)。同时,其肝内出血和坏死性炎症更显著。DAPT处理组小鼠的生存率明显低于对照组。2.抑制Notch信号通路增加了 APAP药物性肝损中炎症细胞的浸润DAPT处理组CD68巨噬细胞的浸润强于对照组。同时,DAPT处理组的中性粒细胞浸润MPO为5.31±0.12U/g,较对照组升高明显(p0.01)。3.抑制Notch信号通路抑制了 Hes1但激活了 HMGB1/TLR4/NF-KB和NLRP3 DAPT处理组中Hes1表达降低。而DAPT处理组中的HMGB1,TLR4,NF-κB和NLRP3的明显升高,半定量分析具有统计学差异(p0.01)。同时,DAPT组中促炎因子IL-1β,TNF-α和IL-6的表达增加,与对照组比较具有统计学差异(p0.05)。4.抑制Notch信号通路促进了对乙酰氨基酚诱导的肝细胞凋亡DAPT处理组中Stat3和Akt的磷酸化被抑制。同时,DAPT组中caspase-3的活性升高。在对乙酰氨基酚处理后,DAPT组中的TUNEL阳性细胞为44.5±1.4 cells/HPF 明显高于对照组 24.2±0.9 cells/HPF(p0.001)。5.抑制TLR4信号通路减轻了对乙酰氨基酚诱导的药物性肝损并且抑制NLRP3的活性在TLR4 KO老鼠中,DAPT处理组肝脏病理显示肝组织的炎症坏死明显减轻。DAPT处理组NK-κB和NLRP3的表达升高,caspase-1活性升高。但是在TLR4 KO老鼠中DAPT的处理导致NK-κB和NLRP3的表达下降,caspase-1亦活性下降,具有统计学差异(p0.05)。6.体外研究显示Notch信号通路调节HMGB1/TLR4/NF-κB和NLRP3的激活LPS处理后,Notch1 siRNA处理组的Hes1表达下降,Stat3和Akt的磷酸化被抑制。但是,HMGB1,TLR4,NF-κB和NLRP3的表达量增加(p0.05)。7.体外研究显示TLR4对于Notch调节NLRP3起着关键作用DAPT处理导致NK-κB和NLRP3的表达升高,caspase-1活性升高,但是通过TLR4 siRNA敲除TLR4后,NK-κB和NLRP3的表达下降,caspase-1活性减低(p0.05)。结论:1.抑制Notch信号通路可以加重对乙酰氨基酚诱导药物性肝损的肝脏损伤,2.抑制Notch信号通路可以增加巨噬细胞和中性粒细胞的浸润,诱导肝脏细胞凋亡;3.抑制Notch信号通路可以通过HMGB1/TLR4/NF-κB促进NLRP3的活化。因此,本研究发现了 Notch信号通路在对乙酰氨基酚诱导药物性肝损的固有免疫反应中有着极为重要的作用。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575

【参考文献】