利用中药小分子单克隆抗体技术解析芍药甘草汤配伍机制

发布时间：2019-05-10 14:09

【摘要】：中药配伍是中医药学的精华部分之一,其独特规律和效用优势已被长期的临床实践所证实,然而迄今仍难以提供其疗效的现代科学依据,成为了中医药学获得国际医药学术界认同的主要门槛。近年来随着科学技术的进步,中药配伍研究,已经取得了不少成绩。但由于中药配伍的复杂系统中存在多渠道、多角度、多层次的相互作用,使得参考西医西药,以还原论为出发点的研究模式,难以真正有效地评价复杂的中药配伍;缺乏综合性研究,难以触及中药配伍的真正科学内涵;缺乏适合中药配伍研究的可操作性强、代表性强的实验思路和技术方法等问题,使得中药配伍研究仍然进展缓慢。中药小分子单克隆抗体技术,具有特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点,用于中药配伍研究有其独特优势。本研究将应用中药小分子单克隆抗体技术,对芍药甘草汤进行多方面综合研究,以解析芍药甘草汤的配伍机制。目的本研究运用中药小分子单克隆抗体技术,研究剂量比例变化、药味加减变化对芍药甘草汤中芍药苷和甘草酸含量、主要成分的体内代谢、药理药效等方面的影响,从而解析芍药甘草汤配伍的"量-时-效"关系,综合分析芍药甘草汤的配伍机制。方法1.利用芍药苷单克隆抗体建立芍药苷在小鼠血中的酶联免疫分析法,并进行方法学考察,包括线性、精密度、准确性、回收率和稳定性等。2.建立HPLC同时检测芍药甘草汤中芍药苷与甘草酸含量的方法。3.制备芍药甘草汤不同配伍比例水煎液(芍药:甘草分别为1:0.33、1:0.5、1:0.67、1:1、1:1.5、1:2、1:3),HPLC检测,并计算其中芍药苷、甘草酸的含量。将上述各组不同配伍比例的芍药甘草汤以及芍药水煎液,灌胃给予昆明小鼠,分别于给药后 10、20、40、60、80、100、120、150、180、240、300、360 min,12 个时间点从小鼠尾尖取少量血(10 μL),采用酶联免疫分析法检测其中芍药苷的含量,并绘制时间-浓度曲线,比较各组之间的差异,计算相关参数。用小鼠热板法致痛模型,考察上述不同配伍比例的芍药甘草汤及芍药水煎液的镇痛药效随时间变化情况。用小鼠二甲苯耳肿模型,考察其抗炎药效。4.制备芍药甘草汤分别与常用中药桂枝、柴胡、黄芩、附子配伍的水煎液,HPLC检测,并计算其中芍药苷、甘草酸的含量。将上述各组水煎液以及芍药甘草汤(芍药:甘草1:1),灌胃给予昆明小鼠,分别于给药后10、20、40、60、80、100、120、150、180、240、300、360 min,12个时间点从小鼠尾尖取少量血(10 μL),用酶联免疫分析法检测其中芍药苷的含量,并绘制时间-浓度曲线,比较各组之间的差异,计算相关参数。用小鼠热板法致痛模型,考察上述给药组的镇痛药效随时间变化情况。用小鼠二甲苯耳肿模型,考察其抗炎药效。5.利用甘草酸单克隆抗体制备甘草酸免疫亲和色谱柱,建立芍药甘草汤中甘草酸的敲除方法,制备敲除甘草酸的芍药甘草汤样品。用LPS诱导HUVEC细胞损伤模型,比较含不同量甘草酸的芍药甘草汤(150%、1000%、90%、800%、50%、10%、0%组)及甘草酸的抗炎作用和相关炎症因子的变化。结果1.建立了小鼠血中检测芍药苷含量的酶联免疫分析方法,线性范围在6.25-800 ng/mL之间,IC50值为41.34ng/mL,板内差的变异系数在4.89%以内,板间差在11.22%以内,平均回收率为105.13%,证明所建立的芍药苷酶联免疫分析方法,灵敏度高、精密度与准确性良好,符合生物样本中芍药苷含量测定的需求。2.建立了甘草酸HPLC检测方法,线性范围为125-2000μg/mL,R2为0.9992。建立了相同条件下芍药苷的HPLC检测方法,线性范围为5-300μg/mL,R2为1,建立了 HPLC同时检测芍药甘草汤中芍药苷和甘草酸含量的方法,可用于芍药甘草汤化学成分的检测。3.HPLC检测不同配伍比例的芍药甘草汤,甘草酸的含量与甘草含量呈线性相关。虽然芍药含量不变,但芍药苷的含量随甘草含量增加而减少,并在甘草量大于芍药时受抑制更加明显。体内代谢研究表明芍药甘草汤中芍药苷Tmax为60 min左右,芍药单药组为40 min左右。在芍药甘草汤中甘草量小于或等于芍药量时,芍药苷Cmax随着甘草量的增加而增加,当甘草量大于芍药时,芍药苷Cmax则下降,在芍药甘草比例1:1时,芍药苷Cmax最高,为 1.74±1.57 μg/mL。镇痛实验表明芍药组镇痛作用最强时间在给药后30 min,芍药甘草汤不同配伍比例各组镇痛作用最强时间均在90 min左右,且随着甘草所占比例增加,痛阈增加值增大,镇痛作用持续时间延长。SG7组在给药后60 min(P0.001),SG4、5、6、7组在给药后90min(P0.05),SG5、6、7组在给药后120min(P0.01,P0.05)痛阈增加值与空白组相比均有明显差异。芍药甘草汤各比例配伍组对二甲苯致小鼠耳廓肿胀均有一定抑制作用,在芍药甘草比为2:1和3:2时肿胀度(P0.001)及肿胀率(P0.05)较模型组降低显著。4.HPLC检测结果表明,与芍药甘草汤(芍药:甘草1:1)相比,不同中药配伍后,甘草酸含量均有明显下降,芍药苷含量除在与黄芩配伍组明显升高外,其他组亦下降。体内代谢研究表明,与黄芩、附子配伍组的芍药苷Tmax为20 min左右,与桂枝配伍组Tmax为40 min左右,芍药苷达峰时间均较芍药甘草汤组提前,而与柴胡配伍组芍药苷Tmax则延后,为80min左右。与芍药甘草汤组相比,各组芍药苷Cmax及AUCtot均有所下降,其中与黄芩配伍组血药峰浓度最高为1.22±0.24 μg/mL,而与柴胡配伍组AUCtot最高为459.89±92.70μg/mL。与柴胡配伍组芍药苷MRT最大为985.90±441.34 min,表明柴胡的加入使芍药苷在体内停留时间延长。镇痛实验表明,与桂枝配伍组镇痛作用最强时间在90min(P0.01),与柴胡配伍组镇痛作用最强时间120 min(P0.05),与黄芩、附子配伍组镇痛作用最强时间都在60 min(P0.01),四组小鼠的痛阈增加值在各时间点均强于芍药甘草汤组。与柴胡配伍组痛阈增加值最低,与附子配伍组痛阈增加值最高。芍药甘草汤1:1比例配伍组、与桂枝配伍组和与黄芩配伍组对二甲苯致小鼠耳廓肿胀有显著性抑制作用(P0.05,P0.01),且芍药甘草汤组抗炎作用最强,肿胀抑制率56.69%。与柴胡配伍组和与附子配伍组无明显抑制肿胀作用(P0.05)。5.利用甘草酸单克隆抗体制备的免疫亲和色谱柱,可敲除芍药甘草汤中的甘草酸及与其结构类似的三萜皂苷类成分。制备不同比例回填液用于LPS干预的HUVEC细胞模型,与模型组相比,含100%甘草酸的芍药甘草汤组及甘草酸组的IL-6和TNF-α的含量都有显著降低(P0.05),且TNF-α可降至与空白组相当水平(P0.05),而其他组对IL-6和TNF-α的影响均不显著(P0.05)。结论1.本实验所建立的小鼠血中检测芍药苷含量的酶联免疫分析方法,线性范围广,灵敏度高,重现性好,符合大量生物样本中芍药苷含量的测定需求。2.本研究首次从"量-时-效"关系的角度综合分析芍药甘草汤配伍机制,发现:①甘草量小于等于芍药时,对芍药苷的溶出量抑制不显著,对芍药苷的体内吸收有促进作用;当甘草量大于芍药时,对芍药苷的体外溶出和体内吸收均表现出明显抑制作用。②甘草使芍药甘草汤镇痛起效时间延迟,镇痛作用时间延长。③芍药甘草汤发挥镇痛与抗炎药效的最佳配伍比例不同。3.首次研究不同药味配伍对芍药甘草汤镇痛抗炎作用"量-时-效"关系的影响,发现:①与芍药甘草汤相比,其他药味加入后,芍药苷的体外溶出及体内吸收大都受到了不同程度的抑制。②芍药苷代谢达峰时间与芍药甘草汤镇痛作用起效时间相关,提示芍药苷在中药复方的镇痛药效中有其独特的作用。4.首次运用中药小分子免疫亲和色谱柱技术研究甘草酸对芍药甘草汤抗炎作用的贡献度,结果表明芍药甘草汤(1:1)抗炎作用与甘草酸相似,但无论甘草酸比例增加或减少都抑制了整体的抗炎作用。说明活性成分在中药复方中与其他成分之间发生相互作用,也存在最佳配伍比例,而并非成简单的线性关系。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R289

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