CTHRC1高表达通过ERK通路激活FRA-1促进食管鳞癌进展的机制研究

发布时间：2019-05-20 04:09

【摘要】：食管癌是一种发病率高的恶性肿瘤,严重威胁人类的健康。中国是食管癌高发区,国内90%以上的食管癌是食管鳞癌。研究食管鳞癌发生发展过程中的分子机制,有助于发现新的治疗靶点和诊断、预后指标,为食管鳞癌的治疗提供新的思路。胶原三螺旋重复蛋白 1(CTHRC1,College Triple Helix Repeat Containing1)是一种分泌性糖蛋白,可抑制胶原基质沉积,促进纤维母细胞和平滑肌细胞的运动。已有研究证实,CTHRC1的生殖系突变与Barret食管和食管腺癌相关。在两个小样本量的研究中发现食管鳞癌中CTHRC1呈现过表达。然而其在食管鳞癌的肿瘤发生和进展过程中发挥的具体作用仍不清楚。我们通过检测食管鳞癌样本中CTHRC1的表达情况探究CTHRC1在食管鳞癌中的临床意义,并通过体内实验、体外实验明确CTHRC1表达上调的机制、CTHRC1对食管鳞癌表型的影响及其作用机制。本实验室前期表达谱芯片数据显示在食管鳞癌组织中的CTHRC1的mRNA表达量显著高于相对应的癌旁组织(差异倍数=20.5,P = 2.12E-66,Wilcoxon 检验;FDR = 2.93E-64,Benjamini-Hochberg 方法)。同时,我们采用免疫组织化学染色技术检测了 204例食管鳞癌组织(其中169例含有与之配对的癌旁组织)中CTHRC1蛋白的表达量,证实相对于癌旁组织,大多数食管鳞癌组织(93.5%,158/169)中CTHRC1蛋白表达量普遍升高。进一步我们进行卡方检验分析证实食管鳞癌组织中CTHRC1高表达与T分期(P = 0.043),淋巴结转移(P = 0.023),TNM分期(P= 0.024)具有显著相关性。Kaplan-Meier生存分析显示相对于CTHRC1低表达的食管鳞癌患者,CTHRC1高表达的患者总生存期较短,预后更差(P = 0.020,Log-Rank 检验)。为了探究食管鳞癌中CTHRC1表达上调的机制,我们通过焦磷酸测序技术检测了 50对食管鳞癌及其配对癌旁组织的CTHRC1启动子区(cg07757887)的甲基化程度,数据显示食管鳞癌组织中该位点的甲基化程度显著低于癌旁组织(n = 50,P0.0001,t检验),92%(46/50)的食管鳞癌组织中该位点的甲基化程度低于其对应的癌旁组织。采用甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-dc)处理食管鳞癌细胞系,发现该位点甲基化程度降低的细胞中CTHRC1的表达量升高。这些数据提示启动子区甲基化水平降低是食管鳞癌中CTHRC1高表达的调控机制之一。体外细胞实验证实过表达CTHRC1可增强食管鳞癌细胞的增殖、侵袭、转移能力,敲降CTHRC1则可抑制食管鳞癌细胞的增殖、侵袭、转移。裸鼠皮下成瘤及尾静脉注射肺定植实验则分别验证了 CTHRC1在体内对食管鳞癌的肿瘤形成和转移的促进作用。接下来,我们对敲降CTHRC1的KYSE510细胞及对照组KYSE510细胞进行RNA测序,筛选出差异基因,并对其进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析,富集到 PI3K-Akt 和 MAPK 信号通路。Western blot实验结果显示敲降CTHRC1的KYSE510细胞和KYSE30细胞中,p-c-Raf、p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达水平明显降低,CTHRC1过表达的KYSE450细胞中,p-c-Raf、p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达水平升高,MEK1/2抑制剂U0126可逆转CTHRC1对KYSE450细胞的增殖、侵袭和转移的促进作用,支持MAPK/MEK/ERK信号通路主要介导了 CTHRC1对食管鳞癌细胞恶性表型的促进作用。进一步,我们通过细胞实验证实CTHRC1激活MAPK/MEK/ERK信号通路,进一步活化FRA-1(Fos-related antigen 1)这一重要的转录因子,从而上调 cyclinD1、snail1、MMP14(Matrixmetallopeptidase14,MT1-MMP)的表达,其中 snail1 介导了 CTHRC1 对MMP14的上调作用。食管鳞癌的表达谱数据中CTHRC1的mRNA表达量与cyclin D1(r = 0.227,P = 0.013)、snaill 的 mRNA(r = 0.550,P0.0001)表达量均具有显著正相关性,snaill的mRNA表达量与MMP14的mRNA表达量也具有显著正相关性(r = 0.318,P = 0.0004)。免疫组化结果中CTHRC1表达量高的患者中,MMP14(P = 0.022)、cyclin D1(P = 0.018)的表达量显著较高。生存分析结果显示cyclin D1高表达(P = 0.049)和MMP14高表达(P = 0.0062)均与食管鳞癌患者不良预后相关。综上所述,CTHRC1在食管鳞癌进展过程中发挥促癌作用,有可能成为食管鳞癌的预后指标及治疗靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.1

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本文编号：2481337