基于铁调素探讨断藤益母汤对类风湿关节炎骨代谢的影响及作用机制

发布时间：2019-06-27 17:56

【摘要】：背景类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性进行性对称性关节炎为主要临床表现的自身免疫性疾病,其发病机制尚不明确。RA的主要病理表现为关节的滑膜炎、炎性细胞浸润、血管翳形成,骨破坏是其最常见的并发症,常累及软骨及骨质,导致骨质疏松,甚至关节结构出现破坏而引起畸形、功能障碍,从而增加了 RA致残率,其危害性非常严重。因此,延缓甚至阻断骨破坏已成为治疗RA的主要策略之一。大量研究认为,RA的慢性炎症是导致其骨破坏的主要因素,但临床实践中发现RA患者即使在炎症得到控制、病情完全缓解的情况下,部分RA患者在疾病后期仍出现关节破坏,即存在所谓的"炎症与骨破坏分离"现象。在应用抗风湿药控制RA病情活动的同时,骨破坏依然存在,此外,虽有生物制剂能延缓骨破坏的报道,却难以完全阻止骨破坏的进展。因此,RA骨破坏的发生机制及治疗方法有待于进一步研究,以期能够抑制RA骨破坏的发生发展。铁调素(Hepcdin,Hepc)是一种在铁代谢中起着重要作用的小分子多肽,其表达受多种因素影响,如血清铁水平、促红细胞生成素、低氧和氧化应激等,在机体铁代谢平衡的调节中起关键作用。近年来的研究发现Hepc水平还受炎症的调节,炎症可以刺激Hepc的生成,在RA患者中血清Hepc水平异常升高,细胞实验证实,铁调素能够促进破骨细胞的分化,上调破骨细胞标志性基因TRAP、CTK和MMP-9的表达。因此推测铁调素可能参与了 RA骨破坏的发生。RA属于祖国医学"痹证"的范畴,主要病机为"肝肾亏虚、风湿瘀阻",其骨质破坏是由于外邪内侵,风湿相搏,病久肝肾亏虚,筋脉失养,邪入脉络,痰瘀交阻,侵害筋骨,以致关节变形,出现骨质破坏。断藤益母汤是针对此病机而确立,具有"补益肝肾、祛风除湿、化瘀通络"的功效,可有效控制RA疾病活动,但尚未对本方对RA骨代谢的影响进行临床观察。本研究来源于广东省自然科学基金资助项目(No.2014A030313403),拟通过临床研究,观察RA患者的骨代谢情况及Hepc的表达情况,及Hepc与骨代谢的相关性;评估断藤益母汤对RA患者临床血清骨代谢指标的影响;通过建立CIA大鼠模型,探讨断藤益母汤对RA骨破坏的影响及其作用机制。一、临床研究目的:观察断藤益母汤对RA骨破坏的临床疗效及安全性,通过对Hepc的水平进行检测,分析其与骨代谢的相关性,进行断藤益母汤治疗RA骨破坏的机制探讨。方法:纳入74例RA患者及20例健康志愿者,将74例RA患者随机分为对照组37例、试验组37例。对照组予甲氨蝶呤片治疗,试验组予断藤益母汤治疗。检测并比较RA患者与健康志愿者的血清铁调素(Hepc)、I型胶原羧基末端肽(β-CTX)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAP5b)、骨特异性碱性磷酸酶(BALP)水平。于治疗后复查两组RA患者的血清Hepc及骨代谢指标,并进行相关性分析,计算DAS28情况进行病情活动评价,分别在基线期及治疗第4、8、12周记录两组患者的TJC、SJC、PGA、MDGA、ESR、CRP、SDAI评分等疾病活动指标及安全性指标,并观察不良反应方发生情况、记录合并用药情况,疗程均为12周。结果:RA患者的血清Hepc、β-CTX、TRAP5b水平均较健康组升高,血清BALP水平降低,差异均有统计学意义(P0.05)。治疗后,试验组DAS28有效率优于对照组,两组差异有统计学意义(P0.05)。两组患者治疗后,TJC、SJC、PGA、MDGA评分均较治疗前改善,对照组在第8周四项指标开始改善(P0.01),至第12周得到进一步改善(P0.01)。试验组从治疗后第4周开始改善(P0.01),第8、12周得到进一步改善(P0.01)。两组TJC、PGA、MDGA比较,第4、8、12周时试验组均显著优于对照组(P0.01);两组SJC比较,第4、8周时试验组均显著优于对照组(P0.01),但至第12周,两组比较差异无统计学意义(P0.05)。两组疾病活动指标均较治疗前得到明显改善(P0.01),治疗第4周试验组CRP、ESR、SDAI评分均开始改善(P0.01或P0.05),第8、12周得到进一步改善(P0.01);对照组至第4周SDAI评分均开始改善,第8周CRP、ESR指标开始改善(P0.01或P0.05),两组CRP比较,第8周时试验组显著优于对照组(P0.01),但至第12周,两组比较差异无统计学意义(P0.05);治疗12周后,试验组ESR、SDAI评分优于对照组(P0.05)。治疗12周后,两组患者Hepc、β-CTX、TRAP5b均降低(P0.01),且试验组Hepc、β-CTX、TRAP5b水平优于对照组(P0.01或P0.05),两组治疗前后BALP比较,差异无统计学意义(P0.05)。治疗前,RA血清Hepc水平与β-CTX、TRAP5b、BALP、ESR、CRP、SDAI均存在明显正相关(P0.01,P0.05);治疗后,RA血清Hepc水平与β-CTX、TRAP5b、ESR、CRP、SDAI均存在明显正相关(P0.01),但与BALP无相关性(P0.05)。安全性分析提示,治疗后,两组患者WBC、PLT降低,RBC、HGB升高,其中两组WBC及对照组PLT、RBC、HGB水平变化差异无统计学意义(P0.05),而试验组中RBC、HGB升高,PLT降低,差异有统计学意义(P0.05)。对照组中1例出现肝功能损害,试验组中4例女性患者出现月经量少。结论:1.RA患者中Hepc水平升高,与骨吸收指标存在明显相关性。2.断藤益母汤能够在控制RA疾病活动的同时,有效改善RA骨代谢水平,抑制骨破坏,其机制可能与抑制血清Hepc表达有关。二、动物实验目的:观察CIA大鼠中Hepc的表达情况及其与骨代谢的关系,评估断藤益母汤对RA骨破坏的治疗作用,并探讨其作用机制。方法:选取65只Wistar.雄性大鼠,随机取60只大鼠用于模型复制,其余5只大鼠作为空白对照组。造模成功后,将造模组随机分为6组:正常组(Control)、模型组(Model)、AG490组、甲氨蝶呤组(MTX)、断藤益母汤低剂量组(DTL)、断藤益母汤中剂量组(DTM)、断藤益母汤高剂量组(DTH)。各用药组均连续给药6周,在造模及用药期间观察大鼠的一般情况,每周进行体重测量及大鼠关节炎指数(Arthritis index AI)评估。末次给药24h后,腹主动脉取血,进行血清Hepc、TRAP-5b、CTX-1检测。取左侧股骨用生理盐水浸透的纱布包裹,用作Micro-CT检测。取右侧股骨,用4%多聚甲醛固定,用于HE染色。分离双侧踝关节滑膜组织,进行RT PCR及Western blot 检测,观察 JAK/STAT 通路中 JAK2、STAT3 的 mmRNA 水平及 p-JAK2、p-STAT3 蛋白水平的变化。应用STATA11.0统计软件进行统计分析。结果:1.Wistar大鼠CIA造模成功率为56.7%。在初次免疫14-18天大鼠足部及踝关节出现关节炎表现,于初次免疫后第4-5周天左右达高峰,随后肿胀逐渐减轻,少数出现关节强直,活动受限,与RA病理过程相似,提示造模成功。2.与Control组比较,Model组大鼠体重减轻,AI评分加重,骨显微结构受损,骨吸收指标及血清Hepc水平升高,且二者存在正相关(Hepc与TRACP-5b的相关性:r=0.6483,PO.0l;Hepc 与 CTX-1 的相关性:r=0.7149,PO.01)。符合本研究所需的研究模型,以进行进一步的药效及机制研究。3.给予断藤益母汤干预后,大鼠体重增加(P0.05),关节炎指数评分减低(P0.05),股骨HE染色及骨形态计量学指标改善(P0.05),骨吸收指标下降(P0.05),呈剂量依赖性,DTH组疗效优于MTX组。4.断藤益母汤治疗后,大鼠血清Hepc下降(P0.05),呈剂量依赖性。5.CIA大鼠炎症发病过程中,JAK/STAT信号通路处于激活状态,JAK2、STAT3的mRNA及P-JAK2、P-STAT3的蛋白表达水平升高,以P-JAK2的蛋白表达上调明显。6.给予大鼠进行AG490干预后,可明显抑制JAK2基因及蛋白表达(P0.05),JAK2下游STAT3分子的mRNA及蛋白磷酸化明显受抑制(P0.05),血清Hepc水平明显下降(P0.05),股骨HE染色及股骨骨形态计量学参数明显改善(P0.05),骨吸收指标下降(P0.05)。7.断藤益母汤能够抑制JAK/STAT信号通路,下调JAK2、STAT3的mRNA及p-JAK2、P-STAT3的蛋白表达水平(P0.05)。结论:1.在RA炎症过程中,骨吸收指标及Hepc的表达水平升高,并且二者存在明显的正相关。2.断藤益母汤可有效改善RA病情、抑制RA骨破坏,其作用呈剂量依赖性。3.RA发病过程中可能通过激活JAK/STAT信号通路,上调了铁调素的表达,进而促进破骨细胞的分化及功能,参与RA骨破坏发病过程。4.断藤益母汤可能通过抑制JAK/STAT通路的相关信号分子的表达,下调铁调素的表达,进而起到骨保护作用。
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【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【参考文献】