二烯丙基三硫醚的体内外生物转化、抗肿瘤活性及逆转顺铂诱发肾毒性的初步研究

发布时间：2019-10-17 19:57

【摘要】：研究背景大蒜是百合科葱属类植物,在我国有悠久的药用和食用历史。流行病学研究显示,大蒜的日常食用能减少许多癌症的发生率。近半个多世纪以来,大蒜中各类成分在抗肿瘤方面的研究在一直处于热点状态,目前已有部分文献记载了众多含硫化合物在抗癌方面的突出活性,尤其以前列腺癌的研究最为集中,其次是乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃癌等。据不完全统计,大蒜中的主要成分二烯丙基硫醚(DAS),二烯丙基二硫醚(DADS),二烯丙基三硫醚(DATS),S-烯丙基巯基半胱氨酸(SAMC)等化合物均报道过抗肿瘤方面的研究。而纵观当前已上市的大蒜类产品,如大蒜精油、老蒜提取物、蒜粉胶囊和片剂,这些产品多作为保健品应用,其中,大蒜精油,老蒜提取物因其混合物成分复杂,且含有的有效成分含量较低,严重限制了其疗效的发挥。而市场上少量的大蒜类药品也多作为抗细菌和抗真菌类药物应用,其市场销售量小,未见其在如抗肿瘤等更为广泛的临床应用,究其原因是缺乏更为深入且规范的研究。综合分析现有文献的研究,可总结出以下缺点:首先是对于目标化合物的选择过于随机。如现有文献中就有报道DAS、DADS、DATS、AMDS、SAC、SAMC,甚至有黑蒜提取物、蒜粉等混合物成分的抗癌作用,少有在结构上探讨过构效和量效关系的描述,亦少有兼顾其溶解度、稳定性以及代谢转化等方面的综合考量;其次,部分研究仅仅在细胞模型评价了各类化合物的抗肿瘤效果,进而探讨各类信号通路机制。由于细胞模型过于理想化,且忽略了药物进入体内的吸收、分布、代谢、排泄过程,特别是无法评价其体内免疫调节的作用;再者,偶有文献虽兼顾了体内动物模型的验证,但肿瘤模型的建立过于随意,如移植肿瘤未生长到指定大小或者刚接种即开始治疗流程,甚至在给药过程中,违背体内研究的本意,直接将药物注射在皮下瘤中;最后,绝大部分研究多为单一成分的体内外抗肿瘤研究,少有联合用药的方案研究,且均未考虑有机硫化合物进入体内后的吸收、代谢、分布情况。总之前期研究的不系统和欠规范,使得多数研究结果的应用价值较低。本课题大蒜有机硫目标化合物以及疾病治疗模型的选择是综合考量了化合物的活性、稳定性、毒性以及其流行性病学的统计结果。前期抗肿瘤药物构效关系研究表明,大蒜有机硫化合物中烯丙基和硫元素是药效官能团,其抗癌活性随着硫元素数目的增多而增强,但其稳定性降低、毒性也随之增大,经综合考量后本课题选择了二烯丙基三硫醚(DATS)单一成分作为化合物研究对象。抗肿瘤应用模型的选择是依据流行性病学统计结果,大数据统计数据表明日常大蒜食用在降低胃癌和肺癌发病率上均有着积极的作用。本课题的实验设计旨在综合体内和体外两个方面,对大蒜中含量较高其活性较强的DATS进行了较为深入的药物代谢和抗肿瘤活性评价,其主要研究内容由以下三部分组成:(1)体内外药物代谢研究,(2)抗胃癌和肺癌的药效学临床前评价,(3)与顺铂联合应用以降低顺铂毒副作用的初步研究。本课题弥补了前期研究的缺陷,为后期蒜类有机硫化合物药物的开发利用提供一些有用的实验依据。研究设计及结果(1)大蒜有机硫化合物DATS的体内外代谢及转化途径研究:在药物代谢研究方面,通过单剂量和多剂量给药大鼠DATS,GC-MS分析显示只在血浆中检测到了甲基烯丙基亚砜(AMSO)和甲基烯丙基砜(AMS02)两个代谢产物,并未检测到DATS的底物峰,说明DATS在血液中代谢较快。DATS体外代谢研究采用了大鼠红细胞模型,以HPLC技术对DATS在大鼠体外的代谢产物进行了定性研究,确证了烯丙基硫醇(AM)和DADS两个主要代谢产物;为了解释体内外代谢结果的不一致性,我们对DATS代谢转化途经进行了更为深入的研究。综合文献查阅,推测化合物甲基烯丙基硫醚(AMS)可能为其中间产物。根据甲基化反应原理,验证AM先在血细胞中甲基化生成AMS,后经由肝微粒体氧化反应生成AMSO和AMS02。而DADS已被报道可转化生成 AM。至此,我们得到 DATS → DADS → AM → AMS → AMSO → AMS02 的转化路径。在动力学方面,DATS在体内有一个迅速的代谢过程,致使体内研究上我们检测不到原型药物;但是其代谢产物AMSO,AMS02,在大鼠血浆中有较长的滞留时间。(2)DATS抗胃癌和肺癌的活性研究:利用体外细胞技术评价了 DATS的抗肿瘤活性,选择SGC-7901和BGC-823作为胃癌模型,NCI-H460为肺癌模型,结果显示DATS对这几种肿瘤细胞均有明显的抑制作用,其作用机制通过调节cyclin家族蛋白阻滞细胞周期、激活caspase级联反应、调节bcl-2家族蛋白和MAPK通路诱导细胞凋亡实现的;在体内抗肿瘤评价中,通过构建人源的肿瘤移植瘤模型,严格按照标准操作,即待肿瘤生长到100-200 mm3,进行分组实验,通过评价包括肿瘤体积、相对肿瘤体积以及相对肿瘤生长率在内的主要指标。结果显示,与对照组相比,DATS对肺癌和胃癌移植瘤均有明显的抑制作用,并且裸鼠体重无明显的降低现象。然而,经计算DATS在各肿瘤上的相对肿瘤增长率T/C(%)值,其均未达到低于40%的规范要求,说明DATS虽然具有一定的抗胃癌和肺癌效果,有可能需要与其它抗肿瘤药物联合使用。通过观察阳性对照顺铂(DDP)组后,发现DDP给药5mg/kg,虽然能达到肿瘤的抑制标准,但是其体重有显著性降低,从侧面说明DDP对机体的损伤严重。鉴于蒜类化合物独有的机体防护作用的特点,本课题设计了DDP和DATS联合治疗方案,结果显示,DATS不仅具有增强DDP疗效的作用,而且DATS联用明显抑制了 DDP单用时引起的体重降低的现象。(3)DATS及其活性代谢产物逆转顺铂诱发的肾毒性研究:顺铂在临床上存在多种副作用,其中肾毒性是临床中十分常见的不良反应。因此,本部分着重研究DATS联合DDP在改善肾毒方面的积极作用。通过构建DDP诱发的BALb/c小鼠肾损伤模型,研究DATS对其防治作用,结果显示,DATS预处理给药后,有效降低DDP引起的肾功能异常,如调节炎症因子的表达,修复肾组织中肾小管周围的损伤和炎症。在机制研究方面,选择人肾小管上皮细胞HK-2作为体外模型,经细胞活力检测显示DATS在体外研究中不具备保护肾细胞的作用。考虑DATS进入体内后形成的其他代谢产物。经过GC-MS检测全血样本和肾组织匀浆样本,确认血液、肾组织中均存在一定量的AMS02。由此本课题以AMS02作为研究目标,细胞活性实验表明其对HK-2细胞基本没有杀伤作用,且联用DDP后,能明显增加细胞活率。此外,AMS02可有效的调节caspase蛋白减少细胞凋亡的发生,显著抑制炎症介质COX-2的产生,以及调节MAPK(包括ERK,JNK,p38)和NFκB通路减少细胞内ROS的异常积累,这些均是AMS02缓解DDP对HK-2细胞毒性损伤的重要机制。此外,在验证MAPK特异性抑制剂的作用时,以JNK和ERK的抑制剂有明显的增加细胞活率和降低细胞凋亡发生的作用。由此说明,JNK和ERK可能是AMS02发挥作用的关键因子。结论本课题综合利用体内外多种代谢模型研究了 DATS的生物转化路径,并鉴定了主要代谢产物;DATS的体外和裸鼠体内抗肿瘤活性规范化研究结果表明其抗胃癌和肺癌的疗效没有达到相对肿瘤增长率T/C(%)值低于40%的规范要求;依据DATS抗肿瘤作用特点,本课题创造性地提出了联合顺铂给药的治疗方案,并验证了 DATS在提高顺铂疗效方面的积极作用;最后,探究了 DATS在缓解顺铂诱发肾毒性方面的积极作用;同时发现了 DATS活性代谢产物AMS02降低肾毒性方面的作用。本研究为大蒜类有机硫化合物的进一步药用开放提供了药物代谢和药效学方面的理论和实验参考数据。
【图文】：

代谢物,质谱,质谱图,甲基

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大鼠,尿液,总离子流,时间段

０－４ｈ逦４－８ｈ逦８－１２ｈ邋１２－２４ｈ逡逑图２－邋６大鼠连续给药２天后，主要代谢物在原液中各时间段的含量逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－邋６邋Ｔｈｅ邋ａｂｕｎｄａｎｃｅ邋ｏｆ邋ＡＭＳＯ邋ａｎｄ邋ＡＭＳ０２邋ｏｆ邋ｕｒｉｎｅ邋ａｆｔｅｉ’
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【参考文献】