SIRT3对小鼠心肌肥厚中线粒体脂质代谢障碍及纤维化的影响及机制研究

发布时间：2017-03-18 22:05

  本文关键词：SIRT3对小鼠心肌肥厚中线粒体脂质代谢障碍及纤维化的影响及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景左室心肌肥厚(left ventricular hypertrophy, LVH)是心脏对于压力或容量超负荷、肌节蛋白基因突变或心肌梗死导致收缩力下降等病理情况的适应性反应,其伴随着多种心脏疾病,如高血压、瓣膜病及缺血性心脏病。在这些疾病的病理过程中,压力负荷过重会导致向心性心肌肥厚,而向心性心肌肥厚被认为是一种具有代偿作用的病理改变因其可以增加左室收缩力、降低室壁压力和心肌耗氧量。然而,左室心肌肥厚同样可以成为严重心力衰竭以及恶性心律失常的危险因素。因此,在不引起循环功能障碍的前提条件下有效的抑制左室心肌肥厚被认为具有重要的临床意义。在寻求抑制左室心肌肥厚方法的过程中,很重要的一点是明确心肌肥厚中不利于其适应性反应的机制。在众多心肌肥厚所带来的不利因素中,能量代谢异常显得尤为突出：在左室心肌肥厚的条件下,心脏的能量代谢方式由主要依靠长链脂肪酸有氧氧化转变为葡萄糖有氧氧化。能量代谢底物的改变一方面可以减少生成每摩尔ATP所需的耗氧量,即能够减少细胞内活性氧簇(Reactive Oxygen Species, ROS)的生成；但另一方面,这一改变不可避免的存在着大量的不利因素,如慢性脂肪酸有氧氧化障碍导致心肌细胞内脂质累积、乳酸堆积、以及糖酵解增多所带来的总ATP水平下降。Van等在于2004年提出心肌代谢重构(metabolic remodeling)的概念,即由心肌细胞在慢性超负荷及底物供应改变时引起的心脏能量代谢途经改变、线粒体功能失调以及高能磷酸盐代谢异常致使心肌能量产生障碍、导致结构和功能异常的现象。但是目前关于左室心肌肥厚过程中脂质代谢障碍的分子学机制尚未清楚。Sirtuins(SIRTs)是一类依赖NAD+辅酶的去乙酰化酶,包含7个不同的亚型。由Shore等于1984年首次在酵母菌中发现,随后SIRTs被发现可以调节酵母菌的寿限,2000年Imai等发现其具有依赖NAD+辅酶的去乙酰化活性并且可以调节细胞的代谢状态。随后的研究发现SIRTs延长寿限的作用机制与热量摄入限制(calorie restriction, CR)类似,提示其对细胞能量代谢的调节作用可能在这一过程种发挥重要作用。由于SIRTs的活性依赖于细胞内NAD+辅酶的水平,且细胞内NAD+辅酶的水平主要由细胞内能量代谢状态决定,因此,SIRTs对于细胞内感知能量代谢的转导通路具有重要的调节作用。最近许多研究发现,SIRTs调控许多关键细胞进程,如胰岛素分泌、细胞周期以及细胞凋亡。目前已经有研究证明SIRTs是治疗代谢紊乱及代谢相关疾病的药物治疗靶点。在已发现的七个SIRT蛋白中,SIRT3是唯一一个被证明其表达水平与人类寿命长度相关的分子。目前,已有研究表明SIRT3具有易化脂类、氨基酸及碳水化合物代谢的作用。且许多研究发现SIRT3可以通过降低细胞内ROS水平发挥心肌细胞保护作用。SIRT3可以去乙酰化多种线粒体内代谢关键酶,如乙酰辅酶A合成酶2 (acetyl-CoA-synthetase 2, AceCS2)长链脂酰辅酶A脱氢酶(Long-chain acyl CoA dehydrogenase, LCAD),琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase),异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase),并使这些代谢酶活性升高。其中,LCAD是一个脂肪酸有氧氧化过程中的关键酶,但是目前关于SIRT3是否能通过影响LCAD活性从而发挥降低心肌肥厚脂质累积的作用尚不清楚。研究目的：1.探讨SIRT3在心肌肥厚中是否具有保护作用。2.探讨SIRT3对心肌肥厚中线粒体脂质代谢的影响。3.研究过表达SIRT3是否能够减轻肥厚心肌细胞中脂质累积。研究方法：1.实验动物：所有动物实验均符合国家卫生部动物管理办法(文案号No.55,2001)和山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的要求和规定。SIRT3-KO小鼠购自美国Jackson实验室,6-7周龄雄性129野生型小鼠购自北京大学动物研究所。2.构建小鼠心肌肥厚模型：我们给予8周龄雄性小鼠(年龄匹配的野生型小鼠和SIRT3-KO小鼠)以胸主动脉缩窄术(TAC)。我们采用戊巴比妥钠对动物进行麻醉,将胸主动脉从周围组织中分离出来,于两侧颈总动脉之间放置27号空针针头(27-gauge needle)然后进行手术缝线结扎,迅速将针头移除。除结扎外,假手术组动物被给予相同处理。所有动物在术后6周处死,将小鼠心脏取材进行肥厚指标和脂质分析等方面的研究。3.免疫组织化学：取材后,组织切片进行HE染色观察形态,进行Masson染色来评估胶原含量。胶原含量采用自动图像分析软件(Image Pro Plus)进行定量分析。4.超声心动图：采用VisualSonics Vevo 770小动物超声进行左室长轴测量,分别采用M-mode、二维超声心动图(2-D)、脉冲多普勒超声(Pulse Wave Doppler, PWD)等模式进行图形采集并分析。5.透射电子显微分析：利用透射电子显微镜(TEM, H-7000FA, Hitachi, Tokyo, Japan)对心肌组织超微结构进行观察分析,放大倍数为15000倍。6.甘油三酯和胆固醇含量分析：心肌组织中的甘油三酯(TG)和胆固醇(cholesterol)采用氯仿、甲醇混合液提取,然后分别采用定量试剂盒进行分析(Biovision Inc)7.离体Langendorff灌流和棕榈酸酯氧化率测定：离体心脏在37℃温箱中进行Langendorff体外灌流(95% 02,5%C02),灌流压力设置为1OOmmHg。经过15分钟的稳定期,灌流液置换为含1mM3H标记的棕榈酰酯的缓冲液,放射量为0.2μCi ml-1,灌流持续1小时。通过在上清液中检测棕榈酰酯氧化生成的3H2O线性增长速度来评价棕榈酸酯氧化率,棕榈酰酯氧化率单位以μmol/g/min表示。8.细胞培养、转染及处理：大鼠肌母细胞系H9C2 (cardiac myoblast)购于ATCC,于含5%CO2的37℃孵箱中培养。所有病毒转染实验使用感染复数(multiplicity of infection, MOI)为10的病毒量进行转染。应用去氧肾上腺素注射液(PE,20μm)刺激H9C2细胞系48小时构建体外心肌细胞肥厚模型。9.细胞内油红0染色及胆固醇、甘油三酯定量分析：用10%的多聚甲醛固定细胞90分钟,随后在油红O染液中孵育3小时后于显微镜下观察细胞内脂质累积情况；细胞内胆固醇和甘油三酯定量分析采用酶比色试剂盒(Wako)进行测定。10.蛋白质免疫印迹：将冻存的心肌组织和处理的细胞用裂解液裂解,提取总蛋白,SDS-PAGE电泳分离蛋白样品,湿转法将蛋白转移到PVDF膜上,封闭后用特异性一抗4℃孵育过夜,然后二抗室温2小时。ECL化学发光液显影目的蛋白条带,LAS-4000化学发光仪检测。11.统计学分析：定量数据均以均数±标准差表示,两组之间比较采用独立样本的t检验；多组之间比较采用one-way ANOVA检验及q检验。设P0.05为有统计学意义。研究结果：1.SIRT3在小鼠肥厚心肌中表达降低我们给予小鼠TAC术,并观察6周。为确保主动脉结扎成功,我们利用超声心动图探查主动脉结扎部位并测量其血流速度。我们通过计算小鼠心重与体重比值,发现小鼠心脏在结扎2周、4周、6周后分别产生20%、40%、60%的心肌肥厚。此外,我们发现与假手术组相比,短片段SIRT3在TAC术后明显降低；而长片段SIRT3在轻度肥厚时轻度上升,在严重肥厚时并无明显表达变化。这些结果与Sundaresan等在类似心肌肥厚疾病模型中获得的结论一致,证实了短片段的去乙酰化蛋白SIRT3在小鼠肥厚心肌中表达降低。2.SIRT3-KO小鼠在TAC术后易于形成心肌肥厚为进一步研究SIRT3在心肌肥厚中所起的作用,我们给与SIRT3-KO小鼠及野生型小鼠TAC术。我们发现与野生型小鼠相比,SIRT3-KO小鼠TAC术后肥厚程度更加严重(15%)。在假手术组,SIRT3-KO小鼠亦出现比野生型小鼠更高的心重体重比。组织学检查显示,无论在TAC还是假手术组,SIRT3-KO小鼠心肌中表现出更加严重的细胞坏死和心肌纤维化。我们利用超声心动图对小鼠心脏进行无创评价：SIRT3-KO小鼠左室后壁在基础水平及TAC术后均较野生型小鼠更厚。此外,左室短轴缩短率(Fraction Shortening, FS)分析显示SIRT3-KO小鼠更加容易形成严重收缩功能障碍。这些研究发现SIRT3-KO小鼠在TAC术后易于出现心脏功能受损及心力衰竭,提示SIRT3在心肌肥厚的过程中发挥重要作用。3.SIRT3-KO小鼠心肌中出现过度脂质积累及脂肪酸氧化速率降低我们利用透射电子显微镜观察小鼠肥厚心肌,结果显示肥厚心肌中线粒体形态出现严重病变。SIRT3-KO在正常情况下未表现出明显的心肌表型变化；野生型和SIRT3-KO小鼠在TAC术后出现明显的脂质累积；但是与野生型小鼠相比,SIRT3-KO小鼠出现更明显的线粒体肿胀,线粒体嵴紊乱以及线粒体内出现大量的泡沫。我们运用其他代谢学检测方法对小鼠心肌检查后发现,甘油三酯及胆固醇水平在TAC术后均升高,在SIRT3-KO、鼠心肌中甘油三酯升高的更加明显,提示心肌细胞脂肪酸氧化功能受损,同时验证了电镜扫描结果。为了直接评估脂肪酸氧化能力,我们利用棕榈酸氧化率进行测算。在野生型小鼠中,棕榈酸氧化率降低30%,而在SIRT3-KO、鼠中,棕榈酸氧化率在正常和肥厚状态下均明显降低。总之,结果显示SIRT3-KO小鼠在心肌肥厚刺激后出现过度脂质累积和脂肪酸氧化率降低。4.SIRT3调控LCAD的乙酰化状态心肌细胞内催化脂肪酸氧化的代谢酶均位于线粒体内,所以我们进一步探讨短片段的去乙酰化蛋白酶SIRT3是否参与脂肪酸氧化的调节。结果显示SIRT3-KO小鼠的线粒体蛋白出现明显的过度乙酰化；在野生型小鼠中,线粒体蛋白出现明显的过度乙酰化且伴随着短片段SIRT3的降低。我们利用抗乙酰化赖氨酸抗体与内源性的线粒体蛋白进行免疫共沉淀,然后用抗LCAD抗体进行蛋白印迹实验,结果显示LCAD在正常状态下可以被乙酰化修饰,在心肌肥厚状态下呈现过度乙酰化状态。当我们对SIRT3-KO小鼠进行同样实验后发现,LCAD在正常和肥厚两种状态下均显示出明显的过度乙酰化状态。这些结果显示出SIRT3对于去乙酰化SIRT3具有必要作用。为了进一步证明SIRT3可以直接去乙酰化LCAD,我们将Flag标记的LCAD病毒载体与SIRT3病毒或空载体病毒共转染小鼠心肌细胞。结果显示,心肌细胞中过表达SIRT3可以降低LCAD的乙酰化程度。总之,这些结果显示去乙酰化蛋白酶SIRT3可能通过调节心肌细胞线粒体内的LCAD的乙酰化状态从而影响脂肪酸氧化作用。5.过表达SIRT3可以减少脂质累积并抑制心肌肥厚反应心肌细胞先进行SIRT3或空载体病毒转染48小时,然后利用去氧肾上腺素(phenylephrine, PE,20μM)或空白对照(生理盐水)刺激心肌细胞。我们发现过表达SIRT3可以降低心肌肥厚标志物α-SMA的表达；通过3H亮氨酸掺入率实验我们发现过表达SIRT3可以降低心肌细胞蛋白合成；同时过表达SlRT3可以降低ANF及β-MHC基因表达。此外,通过油红O染色实验,我们还观察到PE刺激可以是心肌细胞内出现脂滴增多,而过表达SIRT3可以是心肌细胞内脂滴减少。通过脂质定量检测发现,心肌细胞内胆固醇和甘油三酯在PE刺激后均升高,过表达SIRT3可以使其分别降低40%和50%。这些结果显示过表达SIRT3可能通过减低细胞内脂质沉积从而降低心肌细胞肥厚反应。结论：1.SIRT3具有减轻心肌肥厚反应的作用。2.SIRT3可以改善心肌肥厚中线粒体脂质代谢障碍。3.SIRT3可以通过调节LCAD乙酰化状态改善心肌细胞线粒体脂肪酸氧化。研究背景心肌纤维化是一种广泛存在于多种心脏疾病的病理过程,压力超负荷性心脏病(如高血压、主动脉狭窄)因其能够引起广泛而严重的心肌纤维化越来越受到关注。在动物模型中,压力负荷过重在早期可引起心肌肥厚,心肌纤维化及舒张功能异常；在晚期则出现心脏功能失代偿,具体表现扩张性心肌病变及收缩功能减低。胶原纤维合成和分解方面的紊乱可导致心脏结构和功能的异常。纤维化可以使心脏收缩和舒张期心肌细胞电机械偶联功能失调,对心脏收缩和舒张功能产生损害。心肌间质中胶原纤维累积增多可以导致室壁僵硬度增加,使心脏主动舒张功能受损；反之,心肌间质中过度激活的纤维化重构往往涉及到细胞外基质(ECM)降解加强,最终导致心室扩张及收缩功能衰竭。心肌纤维化中胶原网络功能异常常常通过以下机制导致收缩功能减低：第一,胶原纤维的丧失使心肌纤维收缩协调性降低,使得心肌细胞收缩无法转化成正常的心肌收缩力；第二,心肌间质中组成成分的相互作用(如层粘连蛋白,胶原及其受体)对于维持心肌细胞的稳态平衡具有重要作用；第三,心肌纤维化导致心肌细胞被心肌成纤维细胞取代,导致左室扩张。心肌纤维化除了对心脏收缩舒张功能造成巨大影响外,还可通过介导异常折返通路形成从而产生心律失常。SIRT3是一类依赖NAD+的组蛋白去乙酰化酶,是唯一一个被证实其表达水平与人类寿命长度有关的Sirtuin。有研究表明运动和热量摄入限制能够升高SIRT3表达水平。SIRT3在游离脂肪酸氧化功能中发挥重要作用,对于维持细胞ATP水平具有重要意义。在心脏中,SIRT3具有抵抗氧化应激损伤作用从而保护心肌细胞,抑制心肌肥厚形成。SIRT3能够通过去乙酰化调节多种代谢酶和转录因子的乙酰化状态从而影响其活性,参与能量产生,底物代谢,ROS等多种细胞内通路的调节,但是关于SIRT3在心肌纤维化方面的研究较少。如何健康而长寿的生存一直是令人神往的问题,既往研究发现热量摄入限制(Calorie restriction, CR)被认为是一条重要的方法。但在现代社会,食物来源过度丰富以及可利用时间大大减少均使得CR成为不太可能实践的一种方式。尽管接种疫苗、使用抗生素、更好的儿童医疗保护以及疾病早期诊疗措施的联合应用能够帮助延长人类的平均寿命,如何能延长人类的最大寿命限度仍然有待研究。在过去20年衰老领域中的研究中,最大的进展是CR有利方面的重大发现及这些有利方面背后的分子学机制。许多研究提示CR的保护作用依赖于Sirtuins参与。尽管CR对人类健康具有重要的保护作用,这样一种饮食方式似乎并不可能被广泛采用和接受,因为CR可能对衰弱、严重疾患及老年患者造成重大威胁。因此能够提供类似CR有利作用且不限制热量摄入限制的CR模拟物成为研究热点。白藜芦醇(Resveratrol, RSV)是首个被发现的可以通过模拟CR作用从而激活Sirtuin的药物,小鼠长期接受RSV注射可以引起CR类似的基因表达变化,推迟年龄相关的退化。此外,RSV能够抑制自发性高血压大鼠(Spontaneous Hypertension Rat, SHR)心肌肥厚及纤维化。上述研究提示SIRT3在心肌细胞保护方面具有重要作用,而且热量摄入限制和Sirtuin激活的有利作用使得Sirtuin的小分子激活剂成为研究的热点。本研究拟以胸主动脉缩窄术(TAC)构建压力负荷性小鼠心肌肥厚模型,探讨SIRT3在心肌纤维化中的作用机制,并进一步通过体外诱导肌成纤维细胞分化,研究SIRT3在该过程中对纤维化关键转录因子TGF-β/SMAD的调节作用,明确其可能的作用机制及信号通路。研究目的：1.探讨SIRT3对压力超负荷引起的心肌纤维化的影响。2.研究白藜芦醇对小鼠心肌中SIRT3表达水平的影响。3.探讨SIRT3激活通过何种途径减轻心肌纤维化。研究方法：1.实验动物：所有动物实验均符合山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的要求和规定和国家卫生部动物管理办法(文案号No.55,2001)。6-7周龄雄性129野生型小鼠购自北京大学动物研究所,SIRT3-K 0小鼠购自美国Jackson实验室。2.动物饮食：我们在实验中给予动物热量摄入限制饮食(CR),普通对照饮食(Control Dietary,CD)及白藜芦醇补充饮食(RSV supplemental, RSV)。根据AIN-93M (BioServ, Frenchtown, NJ)饮食推荐,我们给予CD组小鼠每周86.4 kcal的食物热量供应,给予CR组小鼠每周64.8 kcal的食物热量供应。RSV组小鼠给予普通对照饮食加1.8mg/kg/天的含RSV的饲养用水供应。3.构建小鼠心肌纤维化模型：我们采用胸主动脉缩窄术(TAC)建立8周龄雄性小鼠(年龄匹配的野生型小鼠和SIRT3-KO小鼠)反应性心肌纤维化动物模型。我们采用戊巴比妥钠对动物进行麻醉,将胸主动脉从周围组织中分离出来,将27号空针针头(27-gauge needle)放置于两侧颈总动脉之间,然后进行手术缝线结扎,迅速将针头移除。除结扎外,假手术组动物被给予相同处理。所有动物在术后8周处死,将小鼠心脏取材进行肥厚和纤维化等方面的研究。4.免疫组织化学：取材后,组织切片进行HE染色观察形态,进行天狼星红染色来评估胶原含量。胶原含量采用自动图像分析软件(Image Pro Plus)进行定量分析。5.超声心动图：采用异氟烷吸入麻醉,采用VisualSonics Vevo 770小动物超声30-Mz进行左室长轴测量,分别采用M-mode、二维超声心动图(2-D)、脉冲多普勒超声(PulseWave Doppler, PWD)等模式进行图形采集并分析。6.原代心肌成纤维细胞分离和培养：我们提取大鼠乳鼠(1-3d)心脏中心肌成纤维细胞。采用含10%胎牛血清及双联抗生素的DMEM培养基培养心肌成纤维细胞,将细胞置于含5%C02的37℃孵箱中培养。7.体外诱导肌成纤维细胞分化：采用血管紧张素2(Angll,1 μ mol/L)刺激心肌成纤维细胞,诱导其向心肌成纤维细胞分化。8.细胞免疫荧光：将细胞置于4%多聚甲醛中固定15分钟,将固定好的细胞置于4℃冰箱,采用1：200稀释的SMA或Smad3一抗过夜孵育,细胞荧光采用激光共聚焦显微镜及软件进行分析。9.蛋白质免疫印迹：将冻存的心肌组织和处理的细胞用裂解液裂解,提取总蛋白,SDS-PAGE电泳分离蛋白样品,湿转法将蛋白转移到PVDF膜上,封闭后用特异性一抗4℃孵育过夜,然后二抗室温2小时。ECL化学发光液显影目的蛋白条带,LAS-4000化学发光仪检测。10.实时定量PCR分析：采用Trizol法提取心肌组织及细胞中的RNA,采用逆转录PCR法将mRNA逆转录为cDNA,使用SYBR green法测定组织和细胞中目的基因的表达量。11.统计学分析：计量资料均以均数±标准差表示,两组之间比较采用独立样本的t检验；多组之间比较采用one-way ANOVA检验及q检验。设P0.05为有统计学意义。研究结果：1.RSV可升高小鼠心肌SIRT3表达水平我们给予野生型小鼠组热量摄入限制饮食(CR)和白藜芦醇补充饮食(RSV)8周,发现CR组心肌组织内SIRT3表达水平较对照组升高1倍以上(*p0.05)。此外,白藜芦醇干预(RSV, 1.8 mg·kg-1·day-1)可以引起与CR作用类似的SIRT3表达水平升高。随后,我们给予野生型小鼠组及SIRT3/-/小鼠组TAC术及假手术组处理(小鼠按不同进食方式进行喂养直至安乐死)。在实验中我们观察到SlRT3在TAC术后水平降低50%,而白藜芦醇干预可维持小鼠心肌内SIRT3的表达水平。2.白藜芦醇抗心肌肥厚作用依赖于SIRT3参与根据心重/体重比值测量,SIRT3-./-小鼠组在压力超负荷刺激下产生更加严重的心肌肥厚(73%in SIRT3 KO+vehicle+TAC组；32%in WT+vehicle+TAC组,*p0.05),白藜芦醇干预可减轻野生型小鼠组心肌肥厚状态,但在SIRT3-/-小鼠组未起到保护作用。白藜芦醇干预可以降低其他心肌肥厚标志物水平,如ANP,Myh-7,但在SlRT3-/-小鼠组未能降低此类胎性基因表达,上述结果提示白藜芦醇改善心肌肥厚作用依赖于SIRT3参与。3.白藜芦醇激活SIRT3可以改善心肌舒缩功能我们对小鼠进行超声心动图检测,结果显示在压力超负荷刺激下,SIRT3-/-小鼠组左室后壁厚度较野生型小鼠组更加肥厚(1.45±0.07 mm,*p0.05)。左室短轴缩短率在TAC术后明显降低,尤其在SⅠRT3-/-组,但左室射血分数在两组间无明显差别。在我们的实验中我们发现压力超负荷容易造成心脏舒张功能异常,其中Aa速度升高及Ea/Aa比值降低均提示舒张功能减低。在我们的研究中发现,SIRT3-/-小鼠组及野生型小鼠组在TAC术后舒张功能均下降,尤其在SIRT3-/-小鼠中更为明显。白藜芦醇可以改善野生型小鼠组心脏舒张功能,但在SIRT3-/-小鼠组未起到明显改善作用。上述研究证实白藜芦醇激活SIRT3可以改善心肌功能,尤其是舒张功能。4.白藜芦醇激活SIRT3可以减轻心肌纤维化心肌纤维化心肌重构的一个重要特征。我们对心肌组织进行天狼星红染色并于偏振光显微镜下观察。在压力超负荷刺激下,SIRT3-/-小鼠组和野生型小鼠组均较假手术组纤维化水平更高,且SIRT3-/-小鼠可自发形成心肌纤维化。白藜芦醇干预可以减轻野生型小鼠心肌纤维化,但在SIRT3-/-小鼠中未观察到此保护作用,提示白藜芦醇的抗纤维化作用依赖于SIRT3参与。通过Western blot检测,心脏中胶原l和胶原Ⅲ在TAC术后表达水平增高。白藜芦醇可以降低野生型小鼠组肥厚心肌中胶原纤维的累积,但并未降低SIRT3+小鼠中的胶原表达。5.白藜芦醇激活SIRT3可以抑制促纤维化分子表达TGF-β、α-SMA及TIMP-2是细胞外基质合成和降解的标志物。SIRT3-/-和野生型小鼠组在TAC术后促纤维化因子水平均升高。白藜芦醇干预可降低野生型小鼠组TGF-β、α-SMA及TIMP-2水平,但是未能降低SlRT3-/-小鼠促纤维化因子表达。TGF-β受体(TRβ1和TRβ2)可以增加SMAD3的磷酸化水平,纤维化中TGF-β通路激活表现在P-SMAD3水平升高。白藜芦醇干预可以降低TGF-β受体表达水平,降低SMAD3的磷酸化水平,但在SlRT3-/-小鼠中并未观察到此作用。因此,白藜芦醇激活SIRT3可以降低促纤维化因子TGF-β、α-SMA及TIMP-2表达水平,并可能通过抑制TGF-β/Smad3通路改善心肌纤维化。6.白藜芦醇可激活心肌成纤维细胞中SIRT3,并抑制肌成纤维细胞分化我们利用不同浓度的白藜芦醇(0-100μM)刺激心肌成纤维细胞24h,发现80μM白藜芦醇可以将SIRT3表达水平升高2倍以上。随后,我们用80μM白藜芦醇刺激心肌成纤维细胞48h,发现80μM白藜芦醇刺激18h可升高SIRT3表达水平2倍以上。我们利用血管紧张素2(Angll)刺激诱导心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞分化,发现肌成纤维细胞重要标志物α-SMA在Angll刺激后表达明显升高。白藜芦醇刺激可以明显降低心肌成纤维细胞α-SMA表达,但当使用小干扰RNA降低SIRT3表达时,白藜芦醇未能降低α-SMA表达。实时定量PCR检测同样发现,白藜芦醇可降低Angll升高的TGF-β及α-SMA基因表达水平,当给予小干扰RNA降低SIRT3表达时,白藜芦醇未能降低TGF-β及α-SMA基因表达水平。7.白藜芦醇激活SIRT3可抑制TGF-β通路及转录因子SMAD3活性我们在实验中观察到,TGF-β在体内和体外纤维化模型中表达均升高,为了探讨SIRT3抗纤维化作用是否与TGF-β通路抑制有关,我们在实验中观察到白藜芦醇干预可以降低TGF-β受体(TGF-β1, TGF-β2)、P-SMAD3及总SMAD3表达水平。且作为转录因子SMAD3的靶基因--纤溶酶原激活物抑制物1(PAl-1)其表达水平也被SIRT3下调。因此白藜芦醇激活SIRT3可能通过抑制TGF-β通路起到改善心肌纤维化的作用。TGF-β通路发挥促纤维化作用依赖于磷酸化的SMAD3,因其磷酸化后通过核转位作用进入胞核发挥转录活性。随后,通过细胞免疫荧光方法及Western blot技术我们观察到Angll刺激可以诱导心肌成纤维细胞中SMAD3的核转位作用,白藜芦醇干预抑制了SMAD3的核转位作用,但当给予小干扰RNA时,白藜芦醇这一抑制作用消失。上述结果提示白藜芦醇激活SIRT3的抗纤维化作用部分依赖于抑制TGF-β/SMAD3通路。结论：1.SIRT3激活可抑制心肌纤维化及心脏功能减低2.白藜芦醇可升高小鼠心肌内SIRT3表达水平。3.SIRT3的抗心肌纤维化作用依赖于对TGF-β/SMAD3通路的抑制作用。
【关键词】：SIRT3 心肌肥厚 脂质累积 长链脂酰辅酶A脱氢酶 去乙酰化蛋白酶SIRT3 心肌纤维化 转化生长因子-β
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.2
【目录】：

• 论文一：SIRT3对小鼠心肌肥厚中线粒体脂质代谢障碍的影响及其机制研究8-66
• 中文摘要Ⅰ8-14
• 英文摘要Ⅰ14-22
• 符号说明Ⅰ22-24
• 前言24-27
• 材料与方法27-42
• 结果42-46
• 讨论46-50
• 创新点50
• 局限性50
• 结论50-51
• 参考文献51-55
• 附图55-66
• 论文二：SIRT3激活对小鼠心肌肥厚中纤维化的影响及机制研究66-124
• 中文摘要Ⅱ66-73
• 英文摘要Ⅱ73-82
• 符号说明Ⅱ82-84
• 前言84-87
• 材料与方法87-101
• 结果101-105
• 讨论105-108
• 创新点108
• 局限性108
• 结论108-109
• 参考文献109-113
• 附图113-124
• 致谢124-125
• 攻读博士学位期间科研情况125-126
• 学位论文评阅及答辩情况表126-127
• 已发表英文论著Ⅰ127-156
• 已发表英文论著II156-183

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1 路义鑫;韩彩霞;张子群;李晓云;赵宇;宋铭忻;;瘦素与巨噬细胞转移抑制因子对感染旋毛虫小鼠心肌损伤致病机制的研究[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年

2 周正质;郭萍;刘常五;黄良月;;地奥心血康对小鼠心肌营养性血流量的影响[A];心脑病药物临床评价专家谈[C];1998年

3 金宏;许志勤;王先远;南文考;高兰兴;;肌酸对改善运动大鼠和小鼠心肌功能的作用[A];中国生理学会第六届应用生理学委员会全国学术会议论文摘要汇编[C];2003年

4 徐蕾;韩国柱;孙慧君;;应用IP-RP-HPLC法测定大鼠及小鼠心肌中磷酸肌酸及其代谢产物的含量[A];第九届全国药物和化学异物代谢学术会议论文集[C];2009年

5 张健发;马依彤;杨毅宁;刘芬;陈邦党;李晓梅;向阳;;后适应缺血时间窗的选择对小鼠心肌再灌注损伤的影响[A];中华医学会心血管病学分会第十次全国心血管病学术会议汇编[C];2008年

6 孙香兰;Laurie Goodyear;高聆;赵家军;;SNARK调节小鼠心肌运动及缺血刺激的葡萄糖摄取[A];中华医学会第十一次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2012年

7 付颖;王丽宏;李强;艾静;;Visfatin在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠心肌中的表达[A];2009中国医师协会内分泌代谢科医师分会年会论文汇编[C];2009年

8 杨戈;欧阳五庆;刘玉梅;王俊;张黎;杨光敏;;EMP对果蝇抗衰老和小鼠心肌抗氧化作用的研究[A];全国动物生理生化第十次学术交流会论文摘要汇编[C];2008年

9 韩彩霞;张子群;路义鑫;李晓云;赵宇;宋铭忻;;瘦素与巨噬细胞转移抑制因子对感染旋毛虫小鼠心肌损伤致病机制的研究[A];第3届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2011年

10 赵yN镭;王晨;杜智敏;;胆碱通过调节miR-133a抗小鼠心肌肥厚作用及机制研究[A];2012年中国药学大会暨第十二届中国药师周论文集[C];2012年

中国博士学位论文全文数据库 前9条

1 陈桐帅;SIRT3对小鼠心肌肥厚中线粒体脂质代谢障碍及纤维化的影响及机制研究[D];山东大学;2015年

2 李传保;乙醛脱氢酶2对代谢综合征小鼠心肌的保护作用及机制研究[D];山东大学;2015年

3 邸若岷;雷帕霉素改善小鼠心肌梗死后心室重构的分子机制研究[D];南京医科大学;2010年

4 程姝娟;Toll样受体4在内毒素诱导的小鼠心肌炎症因子表达和左室功能不全中的作用[D];中国人民解放军军医进修学院;2004年

5 王振华;新生小鼠心肌再生机制的研究[D];北京协和医学院;2013年

6 陈蓉;蛇床子素抑制异丙肾上腺素诱导小鼠心肌纤维化及其机制研究[D];苏州大学;2012年

7 王永梅;黄芩甙抗CVB_（3m）和调控CVB_（3m）感染小鼠心肌免疫损伤及细胞凋亡的实验研究[D];南京中医药大学;2003年

8 周密;MiR-17-92簇在小鼠心肌缺血—再灌注中的作用[D];复旦大学;2011年

9 刘锐;心外膜在新生小鼠心肌再生过程中作用机制的实验研究[D];北京协和医学院;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 陈元元;胰岛素样生长因子Ⅱ受体在病毒性心肌炎小鼠心肌中的表达上调[D];安徽医科大学;2015年

2 刘浩;不同负荷游泳运动对小鼠心肌血管内皮生长因子表达的影响[D];武汉体育学院;2007年

3 杨戈;玉米幼芽提取物对果蝇抗衰老和小鼠心肌抗氧化作用的研究[D];西北农林科技大学;2007年

4 关煜;LY-96在小鼠心肌肥厚及纤维化中的作用研究[D];华中科技大学;2013年

5 曹琳琳;乌苏里藜芦生物碱对小鼠心肌肥大保护作用的实验研究[D];大连医科大学;2008年

6 刘波;雷帕霉素干预炎症因子对小鼠心肌梗死的保护作用[D];华中科技大学;2012年

7 赵宇;瘦素与巨噬细胞转移抑制因子对感染旋毛虫小鼠心肌损伤致病机制的研究[D];东北农业大学;2011年

8 陈琛;耐力、抗阻和混合训练对TNF-α介导的C57BL/6小鼠心肌细胞凋亡的影响[D];华东师范大学;2010年

9 付珊珊;依那普利对新方法造小鼠心肌梗死模型外周血TNF-α、Th1/Th2、Treg/Th17的调节作用[D];南方医科大学;2014年

10 王悦;A乳剂对阿霉素所致小鼠心肌损伤的保护作用及其机制[D];沈阳药科大学;2009年

  本文关键词：SIRT3对小鼠心肌肥厚中线粒体脂质代谢障碍及纤维化的影响及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：255085