单核巨噬细胞系统在弥漫大B细胞淋巴瘤发生发展中作用的临床和实验研究

发布时间：2017-03-19 09:00

  本文关键词：单核巨噬细胞系统在弥漫大B细胞淋巴瘤发生发展中作用的临床和实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B-cell Lymphoma,DLBCL),作为最常见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphoma,NHL),多于50%该患者是可能治愈的。即使在利妥昔单抗时代,大约1/3 DLBCL患者最终将死于复发或难治。大剂量化疗联合自体造血干细胞移植(Autologous Stem Cell Transplantation,ASCT),作为是对挽救性化疗敏感的复发/难治性DLBCL的标准治疗,但是仅对30%此患者有效。因此,对复发难治性DLBCL患者的新的治疗方案研究和探索是必须的。单核巨噬细胞系统(Mononuclear Phagocyte System,MPS)主要包括外周循环的单核细胞、组织中游走或固定的巨噬细胞和树突状细胞。单核巨噬细胞系统作为固有免疫系统的重要组成部分,不仅在机体抗感染、维持自身稳态和免疫监视等方面发挥关键作用,而且因其分化或功能异常参与了如心血管疾病、慢性阻塞性肺疾病、肺结核和自身免疫性疾病等。近年来,因和肿瘤的发生发展关系密切而备受关注。单核细胞作为一群异质性细胞,在吞噬杀伤、炎症、抗原提呈和免疫调节功能方面扮演了重要角色。人类单核细胞根据CD14和CD16表达水平分为三亚群,即经典型(CD14++CD16-)、中间型(CD14++CD16+)和非经典型(CD14+CD16++)。近些年,越来越多临床证据表明CD16+单核细胞(包括CD14++CD16+单核细胞和CD14+CD16++单核细胞)和某些肿瘤密切相关。此外,不同单核细胞群也参与了肿瘤发生发展,如CD14+HLA-DR-/low单核细胞通过抑制机体抗肿瘤反应而发挥免疫抑制作用,酪氨酸激酶受体Tie-2+单核细胞(tie2-expressingmonocytes,tems)参与肿瘤血管生成,ccr2+炎性单核细胞在促肿瘤侵袭转移方面具有重要作用。巨噬细胞是具有多功能的细胞,其中一些作用是相对立的:他们可以免疫刺激或免疫抑制,并促进或抑制炎症。这种功能的可塑性是受局部的巨噬细胞应答信号调节的。肿瘤微环境中的巨噬细胞在不同因子刺激极化下,分为具有抗肿瘤作用的经典激活巨噬细胞(m1型)和促肿瘤功能的选择性激活巨噬细胞(m2型)。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages,tams),大部分表现出m2样的表型和功能,参与了肿瘤生长、浸润、转移和血管生成,且具有很强的免疫抑制功能。由此,近些年来,单核巨噬细胞系统已成为肿瘤靶向治疗感兴趣的重要靶点。然而目前,单核巨噬细胞系统在弥漫大b细胞淋巴瘤发生发展中作用的临床和实验研究甚少。目的全面分析单核细胞绝对计数(absolutemonocytecount,amc)对dlbcl患者预后预测的意义和价值。dlbcl患者外周血不同单核细胞亚群、相关细胞因子和基因水平检测,dlbcl肿瘤微环境中tams和相关趋化因子检测及各自临床意义和作用机制的初步探讨。方法1.在244例初诊dlbcl、163例复发/难治性dlbcl中分别回顾性分析初诊amc、首次复发amc与dlbcl临床预后的关系,220例随访dlbcl中amc预测复发风险的作用。2.收集32例初诊、29例缓解、21例复发dlbcl患者及30例健康对照的外周血标本,流式细胞术检测单核细胞亚群、cd14+hla-dr-/low单核细胞、ccr2+炎性单核细胞、tie-2+单核细胞的分布,酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elasa)方法检测血浆精氨酸酶-1(arginase-1,arg-1)、单核细胞趋化因子-1(monocytechemotacticfactor-1,mcp-1)和血管生成素-2(angiopoietin-2,ang-2)浓度,realtimepcr方法检测外周血单个核细胞中ccr2、tie-2mrna表达水平。3.免疫组化方法检测221例dlbcl石蜡组织标本cd68、cd163、mcp-1、ccr2和pstat3表达特点及预后意义探索。结果1.高初诊amc的初诊dlbcl患者较低amc患者有更低的完全缓解率(completeremission,cr)、总体生存率(overallsurvival,os)和无疾病进展生存率(progressionfreesurvival,pfs)。多因素cox比例风险模型示高初诊amc是dlbcl一独立的不良预后因素,同时结合国际预后指数(internationalprognosticindex,ipi),amc可为dlbcl提供更多的预后信息,比如中危组按初诊amc高低进一步分层,有约20%患者有更低pfs和os,且单独在接受联合利妥昔单抗的免疫治疗患者中分析也得到相似结果。再者,高首次复发amc对于接受二线治疗或敏感者后行大剂量化疗联合asct的复发/难治性dlbcl是一独立的不良预后因素。高首次复发amc的复发/难治性dlbcl患者与低amc患者相比,具有更低的治疗反应率、pfs和os率。结合复发时国际预后指数(internationalprognosticindexatrelapse,saaipi),首次复发amc可为复发/难治性dlbcl进一步分层,比如中危组复发/难治性dlbcl中约有25%患者有更低生存期,且单独在接受联合利妥昔单抗的补救方案治疗患者中也得到相似结果。最后,高随访amc是dlbcl复发的危险因素,且amc预测灵敏度和特意度分别是54.0%和66.7%。高随访amc的dlbcl较低amc患者有更高的复发率、相对危险度及累计风险率。联合随访乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,ldh)水平,不管ldh水平高低,能够得到同样结果。2.初诊dlbcl患者外周血cd14+单核细胞比例(占外周血单个核细胞)、中间型单核细胞比例(占cd14+单核细胞)、cd14+hla-dr-/low单核细胞比例(占cd14+单核细胞)、ccr2+单核细胞比例(占外周血单个核细胞)和tie-2+单核细胞比例(占cd14+单核细胞)均高于健康对照。在dlbcl不同组别中,复发组患者上述细胞群比例分别均高于初诊和缓解组,缓解组低于初诊组。随ipi评分升高,上述细胞比例均呈升高。上述细胞比例在接受标准联合利妥昔单抗方案免疫治疗后,缓解患者缓解时比例低于初诊时,复发患者复发时胞比例高于初诊时。利用受试者工作特征(receiveroperatingcharacteristic,roc)曲线分析初诊dlbcl患者和健康对照组单核细胞数据比较发现,升高的单核细胞群可作为dlbcl早期诊断的指标。相关细胞因子arg-1、mcp-1和ang-2血浆浓度分别与cd14+hla-dr-/low单核细胞比例、ccr2+单核细胞比例和tie-2+单核细胞比例呈正相关。外周血单个核细胞中ccr2、tie-2mrna表达水平与相应流式检测结果一致。3.利用spearman相关分析知dlbcl肿瘤组织中cd68和cd163密度、初诊amc分别和cd68及cd163密度均呈正相关。cd163高表达是dlbcl一独立的不良预后因素。根据cd68和cd163表达高、低,能在ipi评分为低、中危组dlbcl中能筛选出高危患者,cd68高表达和cd163高表达率均随ipi评分的升高而升高。mcp-1阳性表达主要在dlbcl肿瘤细胞胞质,ccr2阳性表达在肿瘤细胞胞质或胞膜,pstat3阳性表达于肿瘤细胞细胞核,且还可观察到ccr2阳性表达于dlbcl组织中的血管内皮细胞和巨噬细胞。mcp-1和ccr2表达水平,pstat3阳性表达分别和mcp-1及ccr2表达水平均呈正相关。mcp-1高表达、ccr2高表达和pstat3阳性表达均是dlbcl一独立的不良预后因素。在不同ipi评分患者中,尤在低、中危组,三者均可筛选出高危患者而提供更多预后信息。mcp-1高表达、ccr2高表达和pstat3阳性表达率均随疾病危险度升高而升高,且有趣地是,利用roc曲线探讨发现mcp-1或ccr2结合ipi较单独ipi具有更好预后判断能力。结论1.amc指标在初诊、复发/难治性dlbcl中是一独立的预后因素,可筛选出高危患者,且随访过程中的动态检测能为复发监测提供有效的信息。2.外周血中间型单核细胞,可作为dlbcl早期诊断的指标,可能在肿瘤发生发展中起重要作用。此外,cd14+hla-dr-/low单核细胞、ccr2+炎性单核细胞及Tie-2+单核细胞可能分别在免疫抑制、促血管生成及肿瘤浸润和转移方面发挥至关重要作用。3.DLBCL肿瘤微环境中TAMs增多是一独立的预后不良因素,且和AMC呈正相关。MCP-1/CCR2轴可能通过STAT3信号通路在肿瘤侵袭转移中扮演重要角色。
【关键词】：弥漫大B细胞淋巴瘤 单核细胞 巨噬细胞 临床预后
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.1
【目录】：

• 英文缩略词表7-10
• 中文摘要10-15
• 英文摘要15-21
• 1 引言21-27
• 1.1 弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）概述21-24
• 1.1.1 DLBCL简介21
• 1.1.2 DLBCL临床预后模型21-22
• 1.1.3 DLBCL生物学预后指标22-24
• 1.2 单核巨噬细胞系统（MPS）概述24-27
• 1.2.1 MPS简介24
• 1.2.2 单核细胞与肿瘤24-25
• 1.2.3 巨噬细胞与肿瘤25-27
• 1.3 本研究立项和意义27
• 2 材料和方法27-42
• 2.1 主要仪器和设备27-28
• 2.2 主要试剂和耗材28-29
• 2.3 引物序列29-30
• 2.4 病例与标本30-36
• 2.4.1 病例与标本收集方法30
• 2.4.2 病例资料及标本特点30-31
• 2.4.3 病例资料整理31-36
• 2.5 实验方法及步骤36-41
• 2.5.1 标本提取与冻存36
• 2.5.2 FCM分析36-37
• 2.5.3 ELISA分析37-38
• 2.5.4 PCR分析38-40
• 2.5.5 IHC分析40-41
• 2.6 统计学处理41-42
• 3 结果42-100
• 3.1 外周血单核细胞绝对计数（AMC）与DLBCL临床和预后分析42-61
• 3.1.1 初诊AMC与初诊DLBCL临床和预后分析42-48
• 3.1.2 首次复发AMC与复发/难治性DLBCL临床和预后分析48-55
• 3.1.3 随访 AMC 监测复发的作用和临床分析55-61
• 3.2 DLBCL外周血单核细胞亚群、CD14+HLA-DR-/low单核细胞、 Tie-2+单核细胞、CCR2+单核细胞和及相关细胞因子、基因水平检测及临床意义分析61-74
• 3.2.1 单核细胞亚群在DLBCL患者和健康对照中的分布特征及临床意义分析61-66
• 3.2.2 CD14+HLA-DR-/low 单核细胞、Tie-2+单核细胞、CCR2+单核细胞和在DLBCL 患者和健康对照中的分布特征、临床意义分析及相关细胞因子和基因水平检测66-74
• 3.3 肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、趋化因子MCP-1 及其受体、pSTAT3在DLBCL中浸润及表达的临床意义探索74-100
• 3.3.1 TAMs在DLBCL中浸润及临床预后研究，且和AMC的关系分析74-85
• 3.3.2 趋化因子MCP-1 及其受体在DLBCL中表达特点及临床预后研究，，且和pSTAT3表达间关系分析85-100
• 4 讨论100-112
• 5 结论112
• 6 本课题的创新点和对课题的进一步设想112-113
• 7 参考文献113-134
• 8 附录134-136
• 8.1 基本个人信息134
• 8.2 教育背景134
• 8.3 在校期间所获奖励134
• 8.4 在校期间参与的科研项目134
• 8.5 攻读博士期间研究成果134-136
• 致谢136-137
• 综述137-147
• 参考文献142-147

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