炎症条件下色素上皮衍生因子（PEDF）对血管通透性的影响及其机制研究

发布时间：2017-03-19 17:07

  本文关键词：炎症条件下色素上皮衍生因子（PEDF）对血管通透性的影响及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的严重烧伤后机体迅速释放大量的炎症介质,引发全身炎症反应,导致血管内皮细胞异常活化和屏障功能障碍,血管通透性增高,进而引起低血容量性休克、筋膜间隙综合征以及多器官功能障碍等一系列并发症,严重危及患者的生命。目前对炎症条件下引起血管通透性增高的因子及其作用机制尚未完全清楚。脓毒症作为大面积烧伤常见的严重并发症之一,其本质为严重感染引起的全身炎症反应综合征,可以模拟典型的炎症条件。在前期研究中,我们通过液相芯片质谱分析发现色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor,PEDF)在严重烧伤脓毒症并发感染性暴发性紫癜患者的血清中表达显著增高,但其在炎症条件下对血管通透性的影响以及作用机制却尚未研究。之所以关注PEDF,是因为它是目前发现的最强新生血管抑制剂,它可以抑制血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)引起的血管生成和血管通透性增高。但是,近年来越来越多的文献提示PEDF也可能是一种内源性的血管活性物质,它可能破坏血管内皮屏障的完整性,这也是目前本领域的研究热点。本研究旨在明确炎症条件下血清PEDF的表达变化,并进一步探讨PEDF对血管通透性的影响及其相关机制。材料和方法1.以脓毒症模拟典型炎症条件,采集严重烧伤脓毒症患者和三种不同脓毒症小鼠(分别为严重烧伤脓毒症、盲肠结扎穿刺(cecal ligation and puncture,CLP)脓毒症和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的脓毒症)的血清,同时采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和蛋白印迹实验(Western blotting,WB)的方法检测血清中PEDF的表达变化。2.制作CLP脓毒症小鼠模型,尾静脉注射外源性PEDF和PEDF单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),观察小鼠气管血管和提睾肌血管荧光微球漏出以及小鼠皮肤微血管伊文思蓝(evan’sblue,eb)漏出情况,同时检测小鼠血液中异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,fitc)标记的右旋糖酐的荧光强度。3.培养人皮肤微血管内皮细胞(humandermalmicrovascularendothelialcells,hdmecs),检测细胞在不同浓度pedf作用不同时间的条件下,跨细胞电阻(transendothelialelectricalresistance,ter)的变化。4.培养hdmecs,随机分为正常对照组、pedf处理组、lps处理组、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,tnf-α)处理组、pedf+lps联合处理组和pedf+tnf-α联合处理组,检测transwell中fitc标记的右旋糖酐漏出情况和rhoa激活情况,同时细胞免疫荧光染色观察应力纤维f-actin和紧密连接闭锁小带(zonulaoccludens-1,zo-1)的形态变化。5.外源性加入rhoa特异性抑制剂c3转移酶,检测细胞transwell荧光漏出情况和rhoa激活情况,同时细胞免疫荧光染色观察应力纤维f-actin和紧密连接蛋白zo-1的形态变化。6.提取细胞膜蛋白和组织总蛋白,检测pedf的受体脂肪甘油三酯酯酶(adiposetriglyceridelipase,atgl)和层粘连蛋白受体(lamininreceptor,lr)在炎症条件下的表达变化,并采用免疫共沉淀(immunoprecipitation,ip)的方法检测pedf与其受体间的相互作用。7.构建pedf受体的慢病毒干扰载体,分别干扰atgl和lr,检测transwell荧光漏出情况和rhoa激活情况,同时细胞免疫荧光染色观察紧密连接蛋白zo-1的形态变化。结果1.以脓毒症模拟典型炎症条件,我们发现在严重烧伤脓毒症患者中,血清pedf的表达是显著增高的。在三种脓毒症小鼠中,血清pedf的表达整体呈增高趋势。具体而言,严重烧伤脓毒症小鼠血清pedf水平从伤后6h开始增高,至12h达到峰值,随后开始下降;clp脓毒症小鼠血清pedf水平从伤后3h开始增高,至12h达到峰值,随后开始下降;而lps脓毒症小鼠血清pedf水平在伤后3h达到峰值,随后出现波动变化。2.在正常小鼠中,大剂量pedf单独作用能够引起血管通透性的增高,表现为荧光微球和eb漏出增多,血液荧光强度降低。在脓毒症小鼠中,血管通透性明显高于正常小鼠,注入外源性pedf能够使得已经增高的血管通透性进一步增高,而注入pedf-mab则能抑制炎症条件下血管通透性的增高。3.pedf对血管内皮细胞通透性的影响呈现剂量和时间的依赖关系。4.在LPS和TNF-α炎症介质处理条件下,内皮细胞旁通透性增高,而外源性PEDF能够使得已经增高的细胞旁通透性进一步增高,表现为Transwell中FITC标记的右旋糖酐大量漏出。PEDF增高内皮细胞旁通透性主要是通过引起应力纤维F-actin的重排和紧密连接蛋白ZO-1的分解。5.大剂量PEDF单独作用能够引起RhoA的激活、应力纤维F-actin的重排和紧密连接蛋白ZO-1的分解。在炎症条件下,PEDF的这种效应更加明显,而RhoA的特异性抑制剂C3转移酶能够抑制PEDF增高血管通透性这一效应。6.在炎症条件下,细胞膜表面和小鼠内脏组织的ATGL受体表达增加,并且与PEDF的相互作用增强,而LR受体无明显变化。7.在ATGL稳定缺失的内皮细胞中,外源性PEDF不能够引起RhoA的激活、细胞旁通透性的增高和紧密连接蛋白ZO-1的分解。而在LR稳定缺失的内皮细胞中,外源性PEDF仍然能够引起RhoA的激活、细胞旁通透性的增高和紧密连接蛋白ZO-1的分解。结论炎症条件下血清PEDF的表达显著增高,与此同时,血管内皮细胞表面的PEDF受体ATGL的表达也显著增多,PEDF与ATGL相互作用后激活下游RhoA,进而引起应力纤维F-actin的重排和紧密连接蛋白ZO-1的分解,从而增高血管通透性。采用PEDF-mAb结合循环中的PEDF、C3转移酶抑制RhoA的激活以及慢病毒载体干扰ATGL受体的表达都能够显著降低PEDF诱导的血管通透性增高。本研究结果在一定程度上阐明了炎症条件下血管通透性增高的发生机制,并且能够为严重烧伤早期因血管通透性增高引起的低血容量性休克和脓毒性休克的临床治疗提供理论依据和作用靶点。
【关键词】：色素上皮衍生因子 血管通透性 脂肪甘油三酯酯酶 层粘连蛋白受体 RhoA
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R644;R459.7
【目录】：

• 缩略语表5-9
• 英文摘要9-14
• 中文摘要14-17
• 第一章 前言17-20
• 第二章 炎症条件下血清PEDF的表达变化20-33
• 2.1 材料与方法20-28
• 2.2 结果28-31
• 2.3 讨论31-32
• 2.4 小结32-33
• 第三章 炎症条件下PEDF对血管通透性的影响33-48
• 3.1 材料与方法33-40
• 3.2 结果40-46
• 3.3 讨论46-47
• 3.4 小结47-48
• 第四章 炎症条件下PEDF增高血管通透性的机制研究48-86
• 4.1 材料与方法48-73
• 4.2 结果73-83
• 4.3 讨论83-85
• 4.4 小结85-86
• 全文总结86-87
• 参考文献87-93
• 文献综述一 色素上皮衍生因子（PEDF）的研究进展93-108
• 参考文献99-108
• 文献综述二The dual effects of PEDF in inflammation108-119
• 参考文献113-119
• 附录119-124
• 攻读学位期间的研究成果124-125
• 致谢125-126

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本文编号：256287