ANO1在自发性高血压大鼠血管中的表达及作用研究

发布时间：2017-03-20 02:05

  本文关键词：ANO1在自发性高血压大鼠血管中的表达及作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：原发性高血压(EH)是一种独立的疾病,同时又是导致动脉粥样硬化、脑卒中等心脑血管疾病的高危因素,因此,如何有效的防治EH的发生发展对于预防心脑血管疾病至关重要。然而,到目前为止,由于EH的发病机制还不清楚,限制了临床上对EH疾病的防治。经典的钙激活氯通道(CaCC)广泛存在于心血管系统中,参与调节心肌细胞兴奋性及血管平滑肌的舒缩功能。然而由于其编码基因未知,限制了经典CaCC在心血管系统中作用的进一步研究,直到Anoctamin1(ANO1)——anoctamins家族中的一员,被证实为经典的CaCC的编码基因,才开启了经典CaCC在心血管系统中的作用研究的新篇章。最新资料表明,ANO1编码的CaCC参与了对机体动脉血压的调节;然而,ANO1是否参与了EH的发病过程呢?目前未见报道。因此,我们以自发性高血压大鼠(SHRs)为EH的动物模型,针对ANO1在EH发生发展过程中可能发挥的作用进行如下探讨:(1)鉴定ANO1在SHRs不同部位血管中的功能性表达的情况;(2)观察ANO1对SHRs血压的影响及可能的机制。研究内容及所用的实验方法:1.利用Western blotting方法观察ANO1在SHRs不同部位血管组织中的表达;急性分离血管平滑肌细胞(VSMCs),利用全细胞膜片钳技术,记录VSMCs ANO1依赖性的钙激活氯电流。2.利用Western blotting方法检测ANO1是否存在糖基化修饰。3.组织贴块法原代培养大鼠VSMCs,观察ANO1的表达及功能。4.利用血管灌流方法,针对大鼠肠系膜动脉环进行研究,利用ANO1的特异性抑制剂T16Ainh-A01探讨ANO1对血管舒缩功能的影响。5.利用siRNA-ANO1干扰技术减弱SHRs内源性ANO1的功能性表达,进一步观察ANO1对SHRs收缩压(SBP)及舒张压(DBP)的影响。6.利用MTT法,观察ANO1在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的VSMCs增殖中的作用;并利用原代培养的VSMCs,借助基因干扰技术进一步验证ANO1对VSMCs胞内钙信号的影响。实验结果:1.与wistar-kyoto(wky)大鼠相比,在shrs颈动脉、胸主动脉、肠系膜动脉及其分支、股动脉及其分支组织中,ano1的蛋白(150kd±)表达均显著增多(p0.01);在原代培养的wky大鼠及shrs主动脉及肠系膜动脉smcs上ano1的蛋白表达水平亦表现出相似的结果;2.与来源于wky大鼠主动脉及肠系膜动脉的smcs相比,在来源于shrs胸主动脉及肠系膜动脉的smcs,可记录到更加强的钙激活氯电流,表明在血管组织中表达的ano1均为功能性cacc。利用sirna-ano1减弱原代培养的shrs肠系膜动脉的smcs,所记录到的钙激活氯电流同未干扰的smcs相比显著减弱;该结果表明,在vsmcs上所记录的钙激活氯电流是由ano1介导的。3.给予糖苷酶f处理从shrs及wky大鼠胸主动脉中提取的蛋白后,检测发现ano1的蛋白分子量由处理前150kd±下降至130kd±的水平,表明在大鼠血管组织中的ano1蛋白存在着糖基化修饰。4.分别给予1,2,5,10,20,30μmol/l的ano1特异性抑制剂t16ainh-a01预孵育shrs及wky大鼠肠系膜动脉环10min,然后给予1μmol/l的苯肾上腺素(pe)收缩血管。结果显示,10μmol/lt16ainh-a01能够显著抑制pe诱导的wky大鼠肠系膜动脉环的收缩,并且能够引起1μmol/lpe预收缩的血管舒张;而20μmol/lt16ainh-a01则能够明显抑制pe诱导的shrs肠系膜动脉环的收缩效应,表明可能是由于shrs肠系膜动脉ano1蛋白表达高于wky,故需更大浓度的抑制剂才能表现出明显的抑制效应。在原代培养的wky肠系膜动脉smcs,10μmol/lt16ainh-a01能够减弱pe诱导的胞内钙荧光信号强度,说明抑制ano1活性,可以通过降低vsmcs胞内钙来引起血管舒张。5.选取12周龄的shrs和wky大鼠,尾静脉注射ano1特异性抑制剂t16ainh-a01,检测40min内大鼠sbp及dbp的变化。结果显示,10μmol/lt16ainh-a01能显著降低wky大鼠的sbp和dbp;而20μmol/lt16ainh-a01则能够明显降低shrssbp和dbp;鼠尾静脉注射sirna-ano1-lipofectamin混合物,减弱shrs内源性ano1的功能性表达,观察注射后5d以内shrs血压的变化情况。结果显示,减弱内源性ano1的功能性表达,能够显著抑制shrs动脉血压(sbp和dbp)(p0.01)的升高。上述结果表明减弱内源性ano1的功能性表达能够降低shrs的sbp和dbp,延缓shrs高血压的进展。由此说明,ano1可能参与了shrs高血压的病理过程。6.在原代培养的wky大鼠肠系膜动脉smcs,angⅡ能够以浓度依赖性方式和时间依赖性的方式显著促进ano1的表达(p0.01);给予1型angⅡ受体(at1r)特异性抑制剂替米沙坦能够显著抑制angⅡ诱导的ano1的表达,而at2r的特异性抑制剂PD123319则未表现出明显的抑制效应;表明AngⅡ可能是通过AT1R介导促进VSMCs ANO1的表达。PI3K/Akt是AT1R的下游信号分子。结果显示,SHRs肠系膜动脉中Akt的磷酸化水平较WKY大鼠显著升高;在原代培养的WKY肠系膜动脉SMCs,AngⅡ能够以时间依赖性的方式提高Akt的磷酸化水平;给予PI3K的特异性抑制剂LY294002能够显著抑制AngⅡ诱导的来源于WKY大鼠的VSMCs ANO1的表达。这一结果表明AngⅡ诱导来源于WKY的大鼠VSMCs ANO1的表达可能是通过AT1R-PI3K-Akt通路来实现的。7.同WKY大鼠肠系膜动脉相比较,SHRs肠系膜动脉增殖细胞核抗原(PCNA)表达显著增多,与原代培养的肠系膜动脉SMCs结果一致;MTT的结果显示AngⅡ能够促进WKY大鼠源性VSMCs增殖;给予ANO1特异性抑制剂T16Ainh-A01能够显著抑制SHRs源性VSMCs及AngⅡ诱导的WKY大鼠源性VSMCs PCNA的表达;同时检测发现,利用siRNA-ANO1减弱SHRs VSMCs ANO1的表达,能够抑制AngⅡ诱导的细胞胞内钙的荧光信号强度。综上所述,ANO1在SHRs血管中高表达,可能促使了高血压的发生发展,这一作用的发挥可能通过两个方面机制来实现:一是促使VSMCs胞内钙的升高,加强SHRs血管收缩;另一方面,通过促进VSMCs增殖,促进SHRs血管重构。本课题通过对ANO1在SHRs血管中的表达及作用的研究为进一步探讨EH的发病机制及有效的防治措施提供了新的靶向及新的作用靶点。
【关键词】：钙激活氯通道 ANO1 自发性高血压 血管重构 血管紧张素Ⅱ
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R544.1
【目录】：

• 摘要2-5
• Abstract5-12
• 引言12-14
• 第一章 材料和方法14-26
• 1.1 实验药品与试剂14-15
• 1.2 实验仪器15-16
• 1.3 实验动物16
• 1.4 实验所需溶液16-17
• 1.5 实验方法17-25
• 1.5.1 Western blotting实验17-20
• 1.5.1.1 样品蛋白的提取17
• 1.5.1.2 BCA法测定样品蛋白的浓度17
• 1.5.1.3 电泳17-18
• 1.5.1.4 转膜（湿转）18-19
• 1.5.1.5 封闭19
• 1.5.1.6 一抗孵育19
• 1.5.1.7 二抗孵育19
• 1.5.1.8 ECL免疫检测19-20
• 1.5.1.9 分析20
• 1.5.2 血管灌流实验20-21
• 1.5.2.1 去内皮肠系膜动脉血管环的制备20-21
• 1.5.2.2 血管灌流实验步骤21
• 1.5.3 组织贴块法培养原代VSMCs21-22
• 1.5.4 膜片钳技术记录VSMCs ANO1诱导的钙激活氯电流22
• 1.5.4.1 急性分离大鼠VSMCs22
• 1.5.4.2 电压钳记录VSMCs钙激活氯电流22
• 1.5.5 MTT法检测VSMCs增殖活性22-23
• 1.5.6 siRNA-ANO1干扰实验23
• 1.5.7 利用Fluo-3AM检测VSMCs胞内钙23-24
• 1.5.7.1 利用Fluo-3AM检测细胞胞内钙的工作原理23
• 1.5.7.2 VSMCs胞内钙检测步骤23-24
• 1.5.8 大鼠血压的测定24-25
• 1.5.8.1 尾静脉注射ANO1抑制剂T16Ainh-A01或者siRNA-ANO124
• 1.5.8.2 尾静脉注射ANO1抑制剂T16Ainh-A01实验分组24
• 1.5.8.3 尾静脉注射siRNA-ANO1分组24
• 1.5.8.4 测量SHRs及WKY大鼠动脉血压24-25
• 1.6 结果分析25-26
• 第二章 实验结果26-48
• 2.1 ANO1在SHRs和WKY大鼠不同部位血管中的功能表达26-31
• 2.1.1 ANO1在SHRs和WKY大鼠不同部位血管组织及VSMCs中的蛋白表达26-27
• 2.1.2 在SHRs和WKY大鼠源性的VSMCs上记录到经典的钙激活氯电流27-30
• 2.1.3 在SHRs和WKY大鼠血管上表达的ANO1存在糖基化修饰30-31
• 2.2 ANO1对SHRs及WKY大鼠去内皮肠系膜动脉环舒缩功能的影响31-34
• 2.2.1 肠系膜动脉环的活性及内皮去除的检测31-32
• 2.2.2 ANO1对PE诱导的去内皮肠系膜动脉环收缩及舒张功能的影响32-34
• 2.3 ANO1对SHRs和WKY大鼠动脉血压的影响34-40
• 2.3.1 抑制ANO1活性对SHRs和WKY大鼠SBP及DBP的影响34-36
• 2.3.2 抑制ANO1活性对SHRs和WKY大鼠心率的影响36-38
• 2.3.3 减弱内源性ANO1的表达对SHRs动脉血压的影响38-39
• 2.3.4 抑制ANO1活性降低PE诱导的VSMCs胞内钙的水平39-40
• 2.4 ANO1在VSMCs增殖中的作用40-44
• 2.4.1 AngⅡ通过AT1R-PI3K/Akt途径上调VSMCs中ANO1的蛋白表达40-43
• 2.4.2 ANO1促进AngⅡ诱导的VSMCs胞内钙的升高43-44
• 2.5 ANO1在SHRs血管中高表达参与了VSMCs的增殖44-48
• 第三章 讨论48-54
• 3.1 ANO1的高表达参与高血压的进程48-49
• 3.2 ANO1以不同的作用机制参与高血压进程49-52
• 3.2.1 ANO1可能通过Ca2+信号通路参与对血压的调节49-51
• 3.2.2 ANO1可能通过促进VSMCs增殖参与EH的进程51-52
• 3.3 ANO1与AngⅡ之间相互作用共同参与高血压的发展52-53
• 3.4 下一步工作计划53-54
• 结论54-55
• 参考文献55-63
• 综述63-80
• 综述的参考文献74-80
• 攻读学位期间的研究成果80-81
• 缩略词表81-82
• 致谢82-83

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王用金;张剑梅;崔学会;;肠系膜动脉血栓8例诊治分析[J];中国医药导刊;2010年02期

2 陈怀生;肠系膜血栓形成2例报告[J];中国实用内科杂志;2001年10期

3 高玉军,陈长明,李正斌,杨文益,赵伟;肠系膜上血栓形成16例分析[J];中国误诊学杂志;2003年09期

4 王建;纪震宇;吴文荣;;非闭塞性肠系膜动脉缺血一例[J];中华创伤杂志;2006年04期

5 巩方明;刘洪俊;石玉龙;;急性肠系膜血管缺血性疾病18例临床分析[J];中国现代普通外科进展;2006年03期

6 吴性江;;肠系膜动脉缺血的诊断和治疗[J];实用临床医药杂志;2009年13期

7 李英,孙建民;急性肠系膜动脉缺血症的治疗[J];国外医学(消化系疾病分册);1983年01期

8 金旦年;;急性肠系膜 缺血的现代概念[J];国外医学.外科学分册;1983年03期

9 冯变喜;王玉仙;侯一丁;贾守仁;傅信孚;;肠系膜动脉非阻塞性梗死(1例报道和文献复习)[J];天津医药;1984年08期

10 孙尚奎,高云瑞,李文汉;小檗胺松弛兔肠系膜动脉条作用原理的研究[J];哈尔滨医科大学学报;1988年04期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 王用金;;肠系膜动脉血栓8例诊治分析摘要[A];中华医学会急诊医学分会第十三次全国急诊医学学术年会大会论文集[C];2010年

2 李文华;曹庆选;杨世锋;李建海;陆升林;张强;吴天;;肠系膜及其血管改变的CT研究——对绞窄性肠梗阻诊断的临床价值[A];第十三届全国临床医学影像学术会议论文汇编[C];2003年

3 陈燕浩;张树桐;金朝林;殷云志;王翔;陈发祥;;64层螺旋CT在冠心病患者肠系膜动脉狭窄临床应用价值初探[A];第十次全国中西医结合影像学术研讨会暨全国中西医结合影像学研究与诊断学习班资料汇编[C];2009年

4 胡伟琦;舒政;孙凤;;肠系膜动脉的64排螺旋CT血管造影研究[A];第十一次全国中西医结合影像学术研讨会暨全国中西医结合影像学研究进展学习班资料汇编[C];2010年

5 王利宏;朱建华;郑良荣;胡申江;陈君柱;Donna H．Wang;;TRPV1在小鼠肠系膜动脉周围神经刺激引起血管舒张中的作用[A];2006年浙江省心血管病学学术年会论文汇编[C];2006年

6 林培敏;曾晓荣;李鹏云;程俊;杨艳;;雄激素舒张高血压患者肠系膜动脉的作用机制研究[A];第八届海峡两岸心血管科学研讨会论文集[C];2011年

7 王颖;郭益民;陈然;张玉青;金們們;余立群;;NFA对SHR肠系膜动脉收缩功能的影响及性别差异[A];浙江省生理科学会2008年学术年会论文汇编[C];2008年

8 王贞;柴强;刘志向;刘德祥;李景新;陈连璧;;Ca2+激活Cl-通道活动对SHR血管张力的影响[A];中国微循环学会第五届中国微循环学术大会论文摘要汇编[C];2004年

9 程俊;曾晓荣;李鹏云;李妙龄;谭晓秋;周文;杨艳;;β-雌二醇对高血压患者肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道作用机制初探[A];第八届海峡两岸心血管科学研讨会论文集[C];2011年

10 文静;李鹏云;程俊;毛亮;刘智飞;曾晓荣;杨艳;;AngⅡ对人肠系膜动脉平滑肌细胞BK_(ca)影响及与AT_2R相关性的研究[A];中国生理学会心血管生理学术研讨会论文集[C];2011年

中国博士学位论文全文数据库 前4条

1 王炳香;ANO1在自发性高血压大鼠血管中的表达及作用研究[D];青岛大学;2015年

2 宋军;肠系膜传入神经在感染后肠易激综合征发病中的作用[D];华中科技大学;2011年

3 董鹏;肠系膜放射解剖学研究[D];四川大学;2004年

4 薛冰;肠炎后肠系膜传入神经敏感性变化及其机制的研究[D];山东大学;2008年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 刘利;川芎嗪对子痫前期患者肠系膜动脉平滑肌细胞BK_(Ca)通道的作用[D];四川医科大学;2015年

2 吴建国;开放肠系膜淋巴管对小肠粘膜损伤修复及功能恢复影响的实验研究[D];中南大学;2012年

3 白波;肠系膜淋巴引流在重症急性胰腺炎并发急性肺损伤中的意义及清胰汤干预作用的实验研究[D];大连医科大学;2009年

4 陈根;mmLDL损伤小鼠肠系膜动脉内皮依赖性舒张功能作用及机制[D];南华大学;2014年

5 林培敏;雄激素舒张高血压患者肠系膜动脉的作用机制研究[D];泸州医学院;2011年

6 钟华;妊娠期高血压疾病患者肠系膜动脉平滑肌细胞BK_(Ca)的改变[D];泸州医学院;2014年

7 陈渝;有氧运动抑制局血压诱导的肠系膜动脉Ca_L通道功能重构[D];北京体育大学;2015年

8 祝晖;孕期高盐对胎羊肠系膜动脉血管细胞钾离子通道的影响[D];苏州大学;2011年

9 李建华;雄激素对高血压患者肠系膜动脉血管BK_（Ca）作用的研究[D];泸州医学院;2010年

10 程俊;雌激素对绝经后高血压女性肠系膜动脉平滑肌细胞BK_(Ca)作用的研究[D];泸州医学院;2012年

  本文关键词：ANO1在自发性高血压大鼠血管中的表达及作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：256947