肝窦内皮旁分泌MIF促进肝内预转移结直肠癌细胞的趋化和生长

发布时间：2017-03-20 10:01

  本文关键词：肝窦内皮旁分泌MIF促进肝内预转移结直肠癌细胞的趋化和生长，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景与目的结直肠癌患者最主要的死亡原因是由于发生了肝转移,大约有三分之一被确诊为结直肠癌的患者在3年内会发生肝转移¨。只有25%伴有孤立肝转移病灶的结直肠癌患者能进行有效的手术切除治疗,并且仅有21%-48%的患者术后生存期超过5年。结直肠癌患者治疗失败和死亡的主要原因是发生转移且形成了转移瘤。Paget在1889年提出的“种子与土壤”假说已经为我们研究结直肠癌的转移机制提供了指导方向,肿瘤细胞与微环境中的支持细胞及它们所产生细胞因子的相互作用,共同参与了肿瘤的侵袭与转移。2003年Fidler修正的“种子与土壤”假说已经明确提出了转移瘤的形成是靶器官微环境相关因子与转移细胞协同作用的产物,抗转移治疗不仅要靶向阻断肿瘤细胞的高转移特性,而且应该对抗靶器官微环境中适应肿瘤细胞生长、血管发生、侵袭和转移的多种细胞与细胞因子,才可能防止和对抗恶性肿瘤转移。肝脏被认为是结直肠癌最常见的转移靶器官,其内微环境非常适合肿瘤细胞生长和转移,因此,探讨其与结直肠癌生长和转移之间密切相关的因素尤为重要。本课题通过比较结直肠癌肿瘤细胞与转移靶器官(肝)及非靶器官内实质和间质细胞之间相互的趋化作用,筛选和鉴定与肿瘤细胞作用密切的关键细胞和细胞因子,阐明其调节肿瘤细胞生长和转移行为的分子机制,针对肿瘤细胞和靶器官微环境协同作用的细胞因子进行治疗,以获得抗种子和抗土壤的双重抗肿瘤转移治疗。研究方法1.筛选结直肠癌转移靶器官(肝)与肿瘤细胞之间起趋化作用的关键细胞。我们首先评估了结直肠癌转移靶器官(肝)来源的与非靶器官来源的正常细胞对结直肠癌细胞的趋化作用。应用Transwell迁移小室实验来比较正常细胞对结直肠癌(CRC)细胞的趋化作用,将人正常的细胞分别置入迁移小室的下层,结直肠癌细胞(SW480、HCT116和LS 1 74T)分别铺在迁移小室的上层。人肝内的正常细胞包括HHSECs(人肝窦内皮细胞)、HL7702(人肝细胞)和LX-2(人肝星状细胞),非靶器官来源的正常细胞包括HUVECs(人脐静脉内皮细胞)、293A(人胚肾细胞)和BJ(人包皮成纤维细胞)。随后将正常细胞和肿瘤细胞的位置互换,HHSECs、HUVECs, HL7702和LX-2细胞置于小室的上层,结直肠癌细胞置于小室的下层,观察肿瘤细胞是否具有趋化正常细胞迁移的能力。2.筛选转移靶器官肝窦内皮细胞(HHSECs)趋化肿瘤细胞迁移的关键细胞因子。收集Transwell、室上室和下室的细胞培养上清液,利用含有1000种人细胞因子抗体芯片筛选出HHSECs趋化肿瘤细胞迁移的关键细胞因子-白细胞游走抑制因子(MIF)。用含有MIF干扰片段的shRNA构建的慢病毒载体包被的病毒颗粒分别转染HHSECs和结直肠癌细胞,以建立稳定干扰MIF表达的细胞株。利用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)技术、免疫蛋白印迹实验(Western Blot)和酶链免疫吸附实验(ELISA)在细胞mRNA和蛋白表达以及外分泌水平检测干扰效率。最后再通过Transwell小室,利用Mock/HHSECs条件培养基,shMIF/HHSECs条件培养基,Mock/HHSECs条件培养基加入p425(MIF特异性抑制剂)以及shMIF/HHSECs条件培养基中加入rhMIF(重组人白细胞游走抑制因子)分别诱导结直肠癌细胞和干扰了MIF表达的结直肠癌细胞,验证在HHSECs趋化肿瘤细胞迁移的过程中是HHSECs旁分泌的ME而非肿瘤细胞来源的MIF起到了关键的作用。3. HHSECs旁分泌MIF对结直肠癌细胞的生物学影响。(1)普通光学显微镜观察用培养了HHSECs细胞的条件培养基再培养肿瘤细胞后,细胞形态发生的改变。(2)运用免疫荧光技术检测HHSECs趋化肿瘤细胞时发生迁移和未发生迁移的细胞是否发生上皮细胞向间质细胞转化(EMT)。(3)通过免疫蛋白印迹法验证HHSECs外分泌的MIF诱导结直肠癌细胞发生EMT。(4)利用细胞计数试剂盒(CCK8)和EdU细胞增殖检测HHSECs旁分泌的MIF对结直肠癌细胞增殖能力的影响。(5)采用流式细胞仪测定HHSECs旁分泌的MIF对结直肠癌细胞周期和凋亡的影响。4.体内验证HHSECs旁分泌的MIF对结直肠癌细胞生长和转移的作用。(1)原位移植裸鼠实验性转移模型用来确定是否HHSECs分泌的MIF能影响CRC细胞的生长、侵袭和肝转移。CRC细胞,CRC细胞混合Mock/HHSECs,CRC细胞混合shMIF/HHSECs和HHSECs分别接种至裸鼠盲肠浆膜下,观察HHSECs分泌的MIF对肿瘤生长和远处转移的影响。(2)将Mock/HHSECs和shMIF/HHSECs分别与干扰了MIF表达的结直肠癌细胞共同种植于BALB/c-Nude裸鼠背部皮下,进一步证实HHSECs外分泌的MIF对肿瘤发生和生长的影响。5.分析MIF与结直肠癌患者临床病理学特征的相互关系。应用免疫组织化学法检测MIF在229例从南方医科大学附属南方医院病理科收集的结直肠癌组织样本中的表达情况,结合患者的临床病理特征,探讨HHSECs分泌的MIF与结直肠癌及肝转移瘤的关系。6.探讨HHSECs旁分泌的MIF趋化结直肠癌细胞迁移的机制。利用免疫蛋白印迹法及免疫荧光技术检测HHSECs分泌的MIF刺激结直肠癌细胞后细胞内骨架蛋白及相关调节因子的改变。研究结果1.肝窦内皮细胞是趋化结直肠癌细胞迁移的关键细胞。我们先评估是否来自肝脏和非特异性靶器官的正常细胞对CRC细胞迁移是否有不同影响。应用Transwell迁移小室来比较正常细胞对CRC细胞趋化的能力,我们将人类正常细胞放置在下层小室,分别将CRC细胞(SW480,HCT116和LS174T)放置在上层小室。肝脏的正常细胞包括]HHSECs,HL7702(人肝细胞)和LX-2(人肝星状细胞)和源自非特异性靶器官的对照细胞如：HUVECs(人脐静脉内皮细胞),293A(人胚胎肾细胞)和BJ(人包皮成纤维细胞)进行比较。该模型模拟了肝血窦内预转移的癌细胞被相邻的细胞趋化的一个过程。结果表明,HHSECs诱导CRC发生迁移的细胞数量是HUVECs诱导的3-14倍(F=1929.169 P0.001),HL7702、LX-2、HL7702、293A、LX-2和BJ细胞诱导CRC细胞的迁移的能力同空白对照组并没有显著差异。来源于转移靶器官的细胞,如HL7702和LX-2,对CRC细胞的迁移能力同来自非靶器官的细胞,如293A(F=0.352 P=0.705)和BJ(F=0.071 P=0.931)相比,并没有积极显著的促进作用。随后,我们将Transwell小室中正常细胞和肿瘤细胞的位置发生对换,置于下层小室的CRC细胞并没有趋化置于上层小室的]HHSECs(F=2.717 P=0.052), HUVECs (F=0.155 P=0.926),HL7702 ((F=56.366 P0.001,由于细胞迁移数均数较少,实际比较的意义并不大)和LX-2(F=1.288 P=0.282)发生显著的迁移。此外,当HHSECs. HL7702和LX-2细胞混合培养来诱导CRC细胞迁移时,混合细胞的化学趋化作用并不强于单独用HHSECs趋化。另外,我们也把以转移到肝脏为特定目标器官的肿瘤细胞,HCC1937(人类乳腺癌细胞),作为一个阳性对照,把另一基本不转移到肝脏的肿瘤细胞,RL95(子宫内膜癌细胞)作为阴性对照,用HHSECs、HL7702和LX-2细胞来分别诱导,有趣的是,HHSECs诱导HCC1937(F=687.850 P0.001)迁移的能力显著强于RL95 (F=1.407 P=0.244),但乳腺癌细胞和子宫内膜癌细胞并没有趋化HHSECs (F=2.753 P=0.072)或HUVECs (F=2.533 P=0.087)迁移的能力。因此,Transwell迁移实验证明HHSECs是趋化CRC细胞转移到特定目标器官一肝脏的关键细胞。2.肝窦内皮细胞旁分泌的MIF是趋化结直肠癌细胞迁移的重要因子。为了确定HHSECs可能会释放哪些介导因子诱导CRC细胞发生明显迁移,我们收集Transwell上室和下室内的细胞培养上清液(条件培养基),用包含1000种抗体的人类细胞因子阵列检测。我们分析了抗体阵列检测数据发现,MIF、 IGFBP-7、Smad 4、SPARC、thrombospondin口Ras的表达在HHSECs培养基中显著高于HUVECs和CRC细胞培养基(F=583.395 P0.001)。这些蛋白中,HHSECs条件培养基同HUVECs、SW480和HCT116细胞培养基相比,MIF的表达是最高的。两种MIF特异性的抑制剂(ISO-1和p425)能抑制HHSECs诱导的CRC细胞迁移。作为阳性对照,在培养基中加入rhMIF(人类重组MIF)后,CRC细胞的迁移能力明显增强。为了评价HHSECs外分泌的MIF介导肿瘤细胞的趋化作用,我们用慢病毒包装的发夹式RNA(shRNA)干扰HHSECs内MIF的表达。应用实时定量PCR(qPCR),蛋白免疫印迹(WB)和酶联免疫吸附实验(ELISA)验证干扰细胞内和外分泌MIF表达的效率。我们发现,Mock/HHSECs条件培养基中加入MIF的抑制剂p425(100 nM)或shMIF/HHSECs条件培养基能抑制HHSECs诱导的迁移作用,但这种抑制作用可以通过补充rhMIF(50 nM)得到恢复。为了阐明HHSECs分泌的MIF还是CRC细胞的MIF在趋化迁移过程中起主要作用,我们干扰了SW480和HCT116细胞内MIF的表达。Mock/HHSECs趋化shMIF/SW480和shMIF/HCT116迁移能力显著强于shMIF/HHSECs和Mock/HHSECs加上p425的诱导作用(F=1653.369 P0.001)。我们也运用WB和ELISA检测是否在其他转移性微环境中的细胞也表达或外分泌MIF,包括HL7702、LX-2和HUVECs。 HL7702,LX-2和HUVECs在细胞内也表达MIF,但是外分泌少量的MIF。我们运用RT-PCR扩增并检测了MIF在HHSECs、SW480、HCT116和HUVECs由mRNA的编码序列,发现它们的序列是一致的。因此,HHSECs分泌的MIF是介导HHSECs趋化CRC细胞迁移的一个关键因子。3.肝窦内皮细胞分泌的MIF促进结直肠癌细胞发生EMT,增殖以及凋亡抵抗。当CRC细胞用HHSECs条件培养基培养后,CRC细胞胞质突起形成海星样的形状。Transwell迁移模型用来展示HHSECs趋化CRC细胞发生迁移的过程中是否发生了EMT。我们发现HHSECs诱导发生迁移的CRC细胞同未发生迁移的CRC细胞相比,强表达间质细胞标志物,如N-钙粘着蛋白(N-ca)和波形蛋白(VIM),弱表达上皮细胞标志物E-钙粘着蛋白(E-ca)。为了确认EMT的发生是否由HHSECs分泌的MIF介导,我们用各种不同的条件培养基培养CRC细胞24小时,WB检测表明,在包含更多的可溶性MIF的条件培养基中,CRC细胞N-ca和VIM表达增强,E-ca表达减弱。运用CCK8实验检测旁分泌的MIF对CRC细胞增殖能力的影响,SW480和HCT116细胞用不同的条件培养基培养。CCK8测定结果表明,含有较高浓度外分泌的MIF条件培养基有利于CRC细胞的增殖,这与EdU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)细胞增殖检测结果相一致。为了探讨旁分泌的MIF促进CRC细胞增殖的相关机制,我们通过流式细胞术检测了MIF对细胞周期的影响。旁分泌的MIF能显著增加G2期的细胞比例(F=79.827 P0.001),但对细胞G1期和S期影响不明显。此外,我们运用膜联蛋白V染色作为凋亡的指标用来衡量凋亡对增殖的影响。可溶性MIF能够抑制5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导CRC细胞的凋亡(F=205.862 P0.001)。总的来说,这些数据提示HHSECs旁分泌的MIF在诱导CRC细胞迁移时能激活EMT,促进肿瘤的细胞增殖和凋亡抵抗。4.HHSECs旁分泌的MIF有利于结直肠癌在体内生长和转移。原位移植裸鼠实验性转移模型用来确定HHSECs旁分泌的MIF对CRC细胞生长、侵袭和肝转移的影响。CRC细胞,CRC细胞混合Mock/HHSECs,CRC细胞混合shMIF/HHSECs和HHSECs分别接种至裸鼠盲肠浆膜下,观察8周。裸鼠被安乐死后,进行大体标本和显微镜下观察。结果显示,CRC细胞混合Mock/HHSECs接种组,结直肠原位瘤的大小、肿瘤生长的速度、体积、重量和形成肿瘤结节的数量,以及在大体和显微镜下观察,肝和肺内形成的转移结节数量(x2=11.356 P0.001)都比单独接种CRC细胞组,或CRC细胞与shMIF/ HHSECs混合接种组显著增加。然而,HHSECs单独接种,本身并不产生任何肿块。此外,shMIF/SW480细胞,shMIF/SW480细胞混合Mock/HHSECs,或shMIF/SW480细胞混合shMIF/HHSECs接种至裸鼠皮下,结果表明,Mock/ HHSECs细胞分泌的MIF能促进肿瘤的发生和肿瘤的生长 (F=13.909P=0.004)。总之,这些结果表明HHSECs分泌MIF能促进CRC细胞在体内形成肿瘤和转移。5.MIF与结直肠癌转移瘤的生长相关。我们用免疫组织化学染色检测MIF蛋白在CRC病人原位瘤样本的表达情况,229例CRC患者的样本来源于南方医科大学附属南方医院病理科。结果显示,MIF在原位瘤的表达水平与肿瘤的侵袭、组织学分期、患者的生存时间、淋巴结和远处转移并没有显著相关性。因此,原位瘤微环境中CRC细胞来源的MIF或其它不确定细胞来源的MIF对肿瘤的预转移并没有起到重要的作用。我们还利用免疫组织化学检测了MIF在29位CRC患者原发肿瘤和肝转移管状腺癌的配对样本中的表达。根据MIF在原位肿瘤和肝转移瘤中表达的不同,我们将所有配对的样本分为两组。A组包括MIF的表达水平在原位瘤中低于肝转移瘤,而B组包括MIF的表达水平的样本在原位瘤中高于或等于肝转移瘤。29对配对样本分析,A组中0例(0%)和B组中5例(45%)患者的肝转移瘤最大直径小于3 cm(P0.05)：A组中18例(100%)和B组中6例(55%)患者的肝转移瘤最大直径大于或等于3 cm(P0.05)。这些结果表明,肝转移瘤的大小和MIF的表达呈正相关,提示HHSECs对肿瘤的生长有促进作用。6. HHSECs旁分泌的MIF诱导CRC细胞迁移通过磷酸化cofilin调节F-actin。阐明旁分泌MIF诱导CRC细胞迁移所涉及的信号通路是至关重要的。我们用之前的方法将CRC细胞用条件培养基来培养。结果发现,用Mock/HHSECs的条件培养基培养与其他条件培养基(shMIF/HHSECs条件培养基、Mock/ HHSECs条件培养基加入p425和基础培养基)相比,CRC细胞内p-cofilin的表达显著增多。然而,在shMIF/HHSECs条件培养基中加入rhMIF后,细胞内p-cofilin的表达也会增强。cofilin磷酸化使其失去活性,导致肌动蛋白细丝的聚合[12]。如WB和免疫荧光结果所示,F-actin的表达在Mock/HHSECs条件培养基培养后明显增强,但用shMIF/HHSECs条件培养基或Mock/HHSECs条件培养基中加上p425培养后,增强的表达会被抵消。为了验证外分泌的MIF信号通路是否会导致CRC细胞内cofilin磷酸化以及参与调节F-action,我们用不同浓度的rhMIF来刺激CRC细胞。结果发现,50 nM rhMIF会导致p-cofilin和F-action表达显著增加,如果rhMIF浓度超过50 nM, p-cofilin和F-action的表达并没有进一步增加。所以,HHSECs分泌的MIF对cofilin/F-action的影响特点提示,它可能通过调节细胞骨架重构促进CRC细胞的迁移。结论1.结直肠癌转移靶器官肝窦内皮细胞是肝内趋化结直肠癌细胞迁移能力增强的关键细胞。2.肝窦内皮细胞旁分泌的MIF是趋化结直肠癌细胞迁移的关键细胞因子。3.肝窦内皮细胞旁分泌的MIF促进肝内预转移结直肠癌细胞的趋化和生长。4.MIF刺激结直肠癌细胞内p-cofilin表达增多与抑制F-actin解聚有关。5.结直肠癌原发癌MIF的表达与患者预后无关,但与肝内转移瘤的生长相关。本研究的创新之处1.展现了肿瘤特异性转移器官内基质细胞参与调节肿瘤生长的旁分泌通路。2.确定HHSECs是趋化预转移结直肠癌细胞迁移的主要诱饵细胞。3.证明HHSECs分泌的MIF而非肿瘤细胞自身的MIF在肿瘤发生、生长以及转移中起到关键的促进作用。4. HHSECs以及其旁分泌的MIF有可能成为抗土壤和抗种子治疗的共同靶点,为对抗预转移状态下肿瘤细胞的增殖和转移治疗提供理论支持。
【关键词】：结直肠癌 肝窦内皮细胞 MIF 旁分泌 趋化 预转移
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-25
• 前言25-28
• 第一章 结直肠癌转移靶器官(肝)与肿瘤细胞之间趋化作用的关键细胞筛选28-42
• 1. 材料28-29
• 2. 方法29-30
• 3. 结果30-38
• 4. 讨论38-42
• 第二章 筛选和验证HHSECs趋化结直肠癌细胞迁移的关键细胞因子42-64
• 1. 材料42-43
• 2. 方法43-52
• 3. 结果52-60
• 4. 讨论60-64
• 第三章 HHSECs旁分泌MIF对结直肠癌细胞生物学特性的影响64-79
• 1. 材料64-65
• 2. 方法65-68
• 3. 结果68-75
• 4. 讨论75-79
• 第四章 HHSECs旁分泌MIF对结直肠癌细胞生长和转移作用的体内验证79-95
• 1. 材料79-80
• 2. 方法80-83
• 3. 结果83-92
• 4. 讨论92-95
• 第五章 HHSECs旁分泌的MIF诱导结直肠癌细胞迁移的机制探讨95-105
• 1. 材料95-96
• 2. 方法96-98
• 3. 结果98-102
• 4. 讨论102-105
• 全文小结105-107
• 参考文献107-120
• 附录 中英文缩略对照表120-121
• 致谢121-124
• 统计学审稿证明124

【共引文献】

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3 董媛媛;刘石萍;孔卫平;王海利;;MIF和MMP-9在食管癌组织中的表达及临床意义[J];中国热带医学;2015年02期

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本文编号：257557