Hsa-microRNA-138-5p靶向调控FOXC1和Vimentin抑制胰腺癌细胞增殖及侵袭转移

发布时间：2017-03-20 12:06

  本文关键词：Hsa-microRNA-138-5p靶向调控FOXC1和Vimentin抑制胰腺癌细胞增殖及侵袭转移，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分Hsa-micro RNA-138-5p在胰腺癌中的表达及临床意义目的:筛选胰腺癌及对应癌旁组织中差异表达的micro RNA(mi RNA),扩大样本数量,判断目标mi RNA在胰腺癌组织、胰腺癌细胞中的表达情况。方法:采用mi RNA表达谱芯片分析3对胰腺癌及对应癌旁组织中mi RNA的差异性表达;实时定量PCR检测目标mi RNA(hsa-mi R-138-5p)在扩大样本量的18对胰腺癌、对应癌旁组织及8株胰腺癌细胞、正常胰腺上皮细胞中的表达情况;收集临床病例资料,分析mi R-138-5p的表达水平与胰腺癌临床病理特征之间的关系。结果:胰腺癌组织差异性表达mi RNAs 80条,其中高表达68条、低表达12条,其中mi R-138-5p在3对胰腺癌中总体低表达,而对应癌旁组织高表达,差异倍数3.64倍。扩大样本显示,mi R-138-5p在胰腺癌组织中的表达比癌旁低,差异有统计学意义(P0.05),其表达水平与胰腺癌病理分化程度及远处转移发生率相关;mi R-138-5p在8株胰腺癌细胞系中的表达分别比正常胰腺细胞低1~10倍,且分化、增殖侵袭能力不同的胰腺癌细胞mi R-138-5p表达水平也有所差异。结论:mi R-138-5p在原发性胰腺癌组织及胰腺癌细胞系中呈低表达水平,与胰腺癌病理分化程度及远处转移发生率相关。第二部分Hsa-micro RNA-138-5p对胰腺癌细胞增殖能力的影响目的:探讨mi RNA-138-5p对胰腺癌细胞体内、外增殖能力的影响。方法:构建mi R-138-5p过表达慢病毒载体、抑制载体,感染胰腺癌细胞株,实时定量PCR检测感染效率;CCK-8、平板克隆形成实验、Ed U细胞增殖法检测mi R-138-5p对胰腺癌细胞增殖的影响;流式细胞术检测mi R-138-5p对胰腺癌细胞周期的影响;构建裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型,检测mi R-138-5p对胰腺癌细胞裸鼠皮下成瘤能力的影响。结果:成功构建mi R-138-5p慢病毒载体,CCK-8、平板克隆实验、Ed U细胞增殖实验结果显示,上调胰腺癌细胞mi R-138-5p表达可显著降低胰腺癌细胞株增殖能力、下调mi R-138-5p表达后胰腺癌细胞的增殖能力明显加强,相对于阴性对照组,差异有统计学意义(P0.05);FCM结果显示,上调胰腺癌细胞mi R-138-5p表达可阻滞细胞周期于G0/G1期;裸鼠皮下成瘤实验显示,mi R-138-5p可抑制胰腺癌细胞皮下成瘤能力。结论:mi R-138-5p对胰腺癌细胞增殖具有明显的抑制作用,抑制胰腺癌细胞裸鼠皮下成瘤能力,其作用至少部分是通过阻滞细胞于G0/G1期而实现的。第三部分Hsa-micro RNA-138-5p对胰腺癌细胞侵袭性和化疗敏感性的影响目的:探讨mi R-138-5p对胰腺癌细胞体、内外侵袭转移能力和化疗敏感性的影响。方法:细胞划痕实验检测mi R-138-5p对胰腺癌细胞迁移能力的影响;Transwell小室侵袭实验检测mi R-138-5p对胰腺癌细胞侵袭能力的影响;选择胰腺癌临床常用化疗药物(吉西他滨和5-氟尿嘧啶),CCK-8检测mi R-138-5p对胰腺癌细胞化疗敏感性的影响;构建裸鼠胰腺癌肝转移模型,检测mi R-138-5p对胰腺癌细胞在动物体内侵袭转移能力的影响。结果:上调mi R-138-5p表达可显著降低胰腺癌细胞株迁移和侵袭转移能力、下调mi R-138-5p表达后胰腺癌细胞的迁移和侵袭转移能力下降,相对于阴性对照组,差异有统计学意义(P0.05);mi R-138-5p可增加胰腺癌细胞对5-氟尿嘧啶的化疗敏感性,其24h、48h及72h实验组IC50值较阴性对照组差异均具有统计学意义(P0.05);裸鼠胰腺癌肝脏转移模型显示,mi R-138-5p可抑制胰腺癌PANC-1细胞在肝脏微转移灶的形成,相对于阴性对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:mi R-138-5p能降低胰腺癌细胞的侵袭及转移能力,增加胰腺癌细胞对5-氟尿嘧啶的化疗敏感性,减少裸鼠体内胰腺癌肝转移模型中肝脏远处微转移灶的形成。第四部Hsa-micro RNA-138-5p的靶基因鉴定及其调控人胰腺癌细胞增殖、侵袭转移的机制目的:明确mi R-138-5p抑制胰腺癌细胞增殖、侵袭转移的作用靶点及机制,阐明mi R-138-5p作用靶基因的生物学功能。方法:运用Target Scan,mi Randa,Micro Cosm等多个mi RNAs靶基因的数据库对mi R-138-5p靶基因进行预测,初步筛选出2个与肿瘤细胞增殖及侵袭转移相关的潜在靶基因——叉头框蛋白C1(fork head box C1,FOXC1)和波形蛋白(Vimentin,VIM),采用双荧光素酶报告基因分别验证mi R-138-5p与FOXC1的3’非翻译区(3’UTR)及VIM的3’UTR存在靶向序列,确定它们的直接靶向调控关系,实时定量PCR及western blot进一步验证mi R-138-5p对胰腺癌细胞FOXC1和VIM基因m RNA及蛋白水平表达影响;利用小干扰RNA(si RNA)检测靶基因FOXC1和VIM对胰腺癌细胞生物学特性的影响。最后,采用western blot及免疫荧光对相关通路蛋白进行初步探讨。结果:荧光素酶报告实验显示,mi R-138-5p可直接结合于FOXC1、VIM的3’UTR,实时定量PCR、western blot也观察到mi R-138-5p可明显抑制FOXC1、VIM基因m RNA和蛋白的表达,差异有统计学意义(P0.05);FOXC1、VIM在胰腺癌组织中明显低表达;si RNA下调胰腺癌细胞FOXC1表达后(模拟mi R-138-5p的作用)胰腺癌细胞增殖能力减弱;si RNA下调胰腺癌细胞VIM表达后(模拟mi R-138-5p的作用)胰腺癌细胞侵袭转移能力减弱,当同时抑制胰腺癌细胞mi R-138-5p和FOXC1的表达后,CCK-8结果显示,单独转染FOXC1 si RNA组细胞数目明显减少,单独转染mi R-138-5p inhibitor组细胞数目明显增加,差异有统计学意义(P0.05),而两者同时转染组细胞数目基本恢复至对照组水平,与对照组比较,差异统无计学意义(P0.05),说明抑制FOXC1表达能减少mi R-138-5p inhibitor引起的促进细胞增殖的效应;当同时抑制细胞中mi R-138-5p和VIM的表达后,Transwell小室侵袭实验显示,单独转染VIM si RNA组细胞数目明显减少,单独转染mi R-138-5p inhibitor组细胞数目明显增加,差异有统计学意义(P0.05),而两者同时转染组细胞侵袭数目基本恢复至对照组水平,与对照组比较,差异统无计学意义(P0.05),说明抑制VIM表达能减少mi R-138-5p inhibitor引起的促进细胞侵袭效应。Western blot对FOXC1下游可能作用基因进行了探讨,结果显示,细胞周期蛋白CNND1的表达显著降低;Western blot结果显示上调胰腺癌细胞mi R-138-5p表达后,细胞上皮标志物E-cadherin表达增强,而间质标志物VIM表达降低,免疫荧光检测也得到同样的结果。结论:mi R-138-5p通过直接靶向调控FOXC1的表达抑制胰腺癌细胞增殖,可能部分由于抑制了周期蛋白CNND1的表达而实现;mi R-138-5p通过直接靶向调控VIM的表达抑制胰腺癌细胞的侵袭转移,可能部分由于调控细胞上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)进程而实现。
【关键词】：胰腺癌 基因芯片 微小RNA 胰腺癌 mi R-138-5p 增殖 皮下成瘤 胰腺癌 mi R-138-5p 侵袭与转移 化疗敏感性 胰腺癌 mi R-138-5p 叉头框蛋白C1 波形蛋白
【学位授予单位】：贵阳医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.9
【目录】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-17
• 略缩词表17-19
• 第一部分 Hsa-micro RNA-138-5p 在胰腺癌中的表达及临床意义19-34
• 引言19-20
• 1.1 材料与方法20-28
• 1.2 结果28-31
• 1.3 讨论31-33
• 1.4 小结33-34
• 第二部分 Hsa-micro RNA-138-5p 对胰腺癌细胞增殖能力的影响34-54
• 引言34
• 2.1 材料与方法34-43
• 2.2 结果43-51
• 2.3 讨论51-53
• 2.4 小结53-54
• 第三部分 Hsa-micro RNA-138-5p 对胰腺癌细胞侵袭转移能力及化疗耐药的影响54-64
• 引言54
• 3.1 材料与方法54-58
• 3.2 结果58-61
• 3.3 讨论61-63
• 3.4 小结63-64
• 第四部分 Hsa-micro RNA-138-5p 靶基因鉴定及其调控人胰腺癌细胞增殖、侵袭转移的机制64-88
• 引言64-65
• 4.1 材料与方法65-72
• 4.2 结果72-84
• 4.3 讨论84-86
• 4.4 小结86-88
• 全文总结88-89
• 参考文献89-95
• 综述95-104
• 参考文献101-104
• 作者简历104-106
• 致谢106-107
• 学位论文数据集107

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 ;MicroRNAs in neural cell development and brain diseases[J];Science China(Life Sciences);2011年12期

  本文关键词：Hsa-microRNA-138-5p靶向调控FOXC1和Vimentin抑制胰腺癌细胞增殖及侵袭转移，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：257734