RECK基因在人腺样囊性癌中的表达、甲基化状态及与临床病理因素及预后的相关性研究

发布时间：2017-03-23 04:10

  本文关键词：RECK基因在人腺样囊性癌中的表达、甲基化状态及与临床病理因素及预后的相关性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：涎腺腺样囊性癌为发生在涎腺的最常见的恶性肿瘤之一,其特点为局部高侵袭性及远处较高的转移率,特别是肺转移、肝转移及骨转移。肿瘤侵犯周围组织的过程就是肿瘤细胞与细胞外基质相互作用的过程,通过调节细胞外基质蛋白的表达,可明显改变肿瘤细胞入侵周围正常组织的过程。基质金属蛋白酶(MMP)家属通过降解基底膜及细胞外基质的主要组分,而在肿瘤侵袭过程中起重要作用,MMP-2是一种比较特异的胶原酶,可特异性的降解细胞外基质及基底膜中的V型胶原,从而破坏周围组织结构,并诱导血管生成。Thereversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs (RECK)基因蛋白可在正常组织中常见表达,而在肿瘤细胞中常为无表达或低表达,RECK基因可通过多种机制抑制金属蛋白酶的活性,可以直接抑制活化的MMP-2,进而从而很好地抑制MMP-2的活性。DNA甲基化是恶性肿瘤中常见的生物学现象,抑癌基因的甲基化可导致其表达的沉默,而癌基因的异常去甲基化可导致其过度表达,目前在涎腺腺样囊性癌中已有数个抑癌基因启动子的甲基化状态进行了相关研究,然而RECK基因在涎腺腺样囊性癌中的表达及甲基化状态仍未见报道。本研究通过免疫组化方法,检测RECK及MMP-2在涎腺腺样囊性癌组织中的表达,并分析其表达与临床病理因素之间的关系,旨在检测其表达在腺样囊性癌进展中的意义；采用甲基化特异性PCR检测腺样囊性癌细胞株中RECK基因启动子区域的甲基化状态；采用Qrt-PCR及western blot检测经5-aza-dC处理后的腺样囊性癌细胞株,RECK基因mRNA及蛋白表达的改变情况；采用transwell侵袭实验检测腺样囊性癌细胞株经药物作用后侵袭力的变化,为其生物学治疗提供新的可能。方法：1.收集临床涎腺腺样囊性癌组织蜡块83例及临床有关资料,采用免疫组织化学染色方法观察RECK及MMP-2蛋白在涎腺腺样囊性癌组织的表达,并对免疫组化结果进行评分,评估RECK及MMP-2的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、临床分期、组织学分类、神经侵犯等的相关性。2.采用卡方检验方法,验证RECK及MMP-2蛋白在涎腺腺样囊性癌组织及癌旁正常组织中表达的相关性。3.采用Kaplan-Meier生存分析方法检验RECK阳性表达患者及RECK阴性表达患者累计生存率的差别。4.采用单因素及多因素回归分析,检测对患者累计生存率有判定意思的临床病理及蛋白指标。5.采用甲基化特性性PCR检测人腺样囊性癌细胞系ACC-2、ACC-M中RECK基因启动子区域的甲基化状态,并采用不用浓度的5-aza-dC处理人腺样囊性癌细胞株不同时间,查看RECK基因启动子区域甲基化状态的改变情况。6.采用实时定量PCR及western blot检测经不用浓度5-aza-dC作用人腺样囊性癌细胞株不同时间后,RECK基因mRNA及蛋白表达的改变情况。7.采用transwell侵袭实验检测,经不同浓度5-aza-dC处理人腺样囊性癌细胞株72小时,检测该细胞株侵袭力的改变情况,结果：1.免疫组化结果显示,在涎腺腺样囊性癌组织中,RECK表达阴性或者呈弱表达,而MMP-2多为高表达；癌旁正常组织临床样本中,RECK基因多高表达,而MMP-2多为低表达或不表达；通过临床资料统计分析发现,在涎腺腺样囊性癌中RECK蛋白的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小无关,与TNM分期、病理类型、及神经侵犯显著相关,而MMP-2与TNM分期及神经侵犯显著相关,而与病理类型无明显相关。2.在RECK蛋白阳性(+、++)表达的组织中,MMP-2的阳性表达率为45.5%(10/22),而在RECK蛋白阴性(-)表达的组织中,MMP-2的阳性表达率为95.2%(59/62), Pearson's χ2结果显示RECK在腺样囊性癌组织中的表达与MMP-2的表达成明显负相关(x2=38.202,p=0.000)。3.腺样囊性癌术后患者的随访时限平均为54个月(范围,10-120月),42名患者死于腺样囊性癌复发或转移,5名患者失访,4名患者(4.2%)死于其他疾患,32名患者(44.4%)到随访截止日仍存活。生存曲线显示,RECK阳性表达的患者的总体生存率明显高于阴性表达者(p=.004)4.单因素Cox回归模型分析显示RECK、MMP-2、病理类型、TNM分期、神经侵犯与患者预后显著相关,而多因素cox回归模型显示只有RECK表达及病理类型是患者预后的独立指标(P=0.043)5.甲基化特异性PCR检测发现,ACC-M细胞株中可见非甲基化及较强的甲基化条,而ACC-2细胞株中仅可见较强的非甲基化条带,经5-aza-dC处理后ACC-M细胞中RECK基因甲基化状态得到逆转。6.实时定量PCR及western blot检测发现,经5-aza-dC处理后,ACC-M细胞中RECK基因mRNA及蛋白的表达得到显著提升。7. transwell侵袭实验检测发现,经5-aza-dC处理后ACC-M细胞株72小时后。ACC-M细胞株的侵袭力明显降低结论：RECK在涎腺腺样囊性癌组织中的表达明显低于癌旁正常组织,低表达的RECK与涎腺腺样囊性癌的临床分期及组织学类型、神经侵犯相关；RECK基因对涎腺腺样囊性癌的抑制作用可能是通过抑制基质金属蛋白酶-2的活性,从而提高了患者的累计生存率,RECK的检测可作为涎腺腺样囊性癌临床诊断、判断预后、诊疗方案制定及潜在生物标记物和分子指标。甲基化转移酶抑制剂5-aza-dC可明显提高RECK基因mRNA及蛋白的表达,并明显降低腺样囊性癌细胞系的侵袭力,其机制可能为药物恢复了金属蛋白酶抑制剂RECK的表达有关,这为涎腺腺样囊性癌的生物治疗提供了新的可能。
【关键词】：涎腺腺样囊性癌 RECK 预后 甲基化 transwell侵袭实验
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.8
【目录】：

• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-16
• 符号说明16-17
• 第一章 RECK基因在涎腺腺样囊性癌中的表达及与患者预后的相关性研究17-33
• 前言17-18
• 材料与方法18-20
• 结果20-21
• 讨论21-24
• 附图24-30
• 参考文献30-33
• 第二章 涎腺腺样囊性癌细胞中RECK基因甲基化水平的研究33-44
• 前言33
• 材料与方法33-36
• 结果36
• 讨论36-38
• 附图38-39
• 附表39-40
• 参考文献40-44
• 第三章 5-氮杂-2'-脱氧胞苷对人腺样囊性癌细胞RECK基因表达及肿瘤侵袭力的影响44-61
• 前言44-45
• 材料和方法45-53
• 实验结果53-54
• 讨论54-56
• 附图56-59
• 参考文献59-61
• 致谢61-62
• 攻读博士学位期间发表的文章62-63
• 学位论文评阅及答辩情况表63-64
• 英文论文一64-82
• 英文论文二82-101

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