BRF2蛋白表达与非小细胞肺癌、食管癌侵袭转移及预后的相关性研究

发布时间：2017-03-23 09:05

  本文关键词：BRF2蛋白表达与非小细胞肺癌、食管癌侵袭转移及预后的相关性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景及意义中国肿瘤登记年报显示相比发达国家而言,中国的高发肿瘤分别为肺癌、胃癌、结直肠癌及食管癌等,肺癌是严重威胁人类健康和生命的常见恶性肿瘤之一,是恶性肿瘤致死的首要因素。尤其是近几十年来,随着工业发展导致的大气污染及雾霾加重,世界各国肺癌的发病率和死亡率均有明显增高的趋势；此外,食管癌是我国高发肿瘤,而且患者五年生存率较低；癌症的治疗方法主要有手术治疗、放射治疗、化学药物治疗、中医中药治疗、免疫治疗及近几年发展迅速的靶向治疗等,但大多数患者确诊时已属中晚期,失去有效的治疗时机。目前,所有的各种治疗肺癌的方法其效果均不令人满意,致使肺癌及食管癌患者的5年生存率及无病生存率近些年来并未得到明显的改善。侵袭和转移是导致患者死亡的主要原因,细胞的扩散(癌细胞从原发肿瘤扩散至远处器官过程)及它们无情的生长是肿瘤最可怕的一面；尽管在手术技术、诊断及时性、病人基础护理及综合治疗等方面现代医学已经取得了很大的提高,但是因癌细胞侵袭转移引起的病人死亡仍然是癌症患者及医生共同面对的最大的敌人。尽管近年来有关肿瘤侵袭转移的治疗理论上没有任何实质性的大的进展,但是在分子基因水平认识肿瘤侵袭转移的分子机制及其相应的治疗策略仍然是肿瘤研究者关注的重要方面。肿瘤细胞挣脱固体肿瘤组织的过程涉及多个生物学步骤,包括肿瘤细胞之间粘附力的降低,肿瘤细胞逃脱基底膜,细胞外基质的降解,肿瘤细胞进入微血管及淋巴管,微转移灶的形成及肿瘤转移微环境的形成及肿瘤细胞免疫逃逸等；肿瘤细胞与周围微环境之间的相互作用是连续的、多阶段的、极其复杂的动态过程。如何阻断上述肿瘤细胞侵袭转移的过程是阻止肿瘤细胞侵袭转移重要课题。像正常组织一样,肿瘤组织需要持续供给生长所需的氧气及养料,以及及时的排除代谢所产生的二氧化碳及代谢废物；肿瘤组织依靠肿瘤新生血管组织及新生淋巴管组织解决这一需求。成人体内,只有包括创伤修复等少数情况下存在着新生血管的生成。而在肿瘤发生发展的过程中,血管生成的过程是持续存在的,用以维持肿瘤细胞不断的分裂。肿瘤新生血管的形成过程同时也是肿瘤转移瘤生存发展的重要过程,而且最近研究发现血管的生成在一定程度上促进了肿瘤转移瘤的生长,同时肿瘤转移瘤的生长进一步促进了肿瘤新生血管的生成,而且这一双向调节过程的空间性广泛,并不仅仅是刺激产生的一处转移瘤;这很可能是侵袭转移一旦发生,机体会出现难以控制多发转移的原因所在。肿瘤血管的生成受多种因素调控,包括促进血管生成因素及抑制血管生成因素。这些调节因素最后都结合于血管内皮调控蛋白。因此,切断肿瘤血管生成的调控途径或者肿瘤血管生成的信号接受途径将会抑制肿瘤新生血管的生成,进而在一定程度上控制肿瘤侵袭转移。从而,抑制肿瘤生长的新途径-抗肿瘤血管生成治疗成为现代肿瘤治疗领域的一个重要策略。BRF2基因位于染色体8p12位置,是转录因子TFⅢB上的亚基；参与RNA聚合酶Ⅲ催化小分子RNA生成。BRF2基因与TFⅢB之间的关系决定了BRF2蛋白在肿瘤发生发展过程中存在重要作用,起到肿瘤调控的“桥梁”作用。近年来,BRF2蛋白在恶性肿瘤血管生成过程中的作用越来越引起学者们的重视,研究发现BRF2基因高表达在乳腺癌、胃癌、肾癌、黑色素瘤及淋巴瘤中均被检测到,通过比较基因杂交技术证明,染色体8p12的局部性扩增在大约40%的肺部鳞状细胞癌的发生发展过程中扮演着重要角色；进一步研究指出BRF2过度表达和临床结果之间存在相关性,癌基因BRF2在肺部鳞状细胞癌的侵润前阶段中会频繁被激活。研究提示,BRF2蛋白可能在肿瘤侵袭转移过程中存在着重要的作用,BRF2蛋白可能对肿瘤侵袭转移的血管生成这一重要关键步骤存在有调控作用。为了进一步探究BRF2基因与非小细胞肺癌及食管癌侵袭转移之间关系,我们进行了一下4个方面的研究：①检测BRF2蛋白表达与早期非小细胞肺癌血管生成及预后的相关性研究；②检测BRF2蛋白表达与食管癌血管生成及预后的相关性研究；③通过RNA干扰技术敲除BRF2基因,进一步检测敲除BRF2基因前后非小细胞肺癌体外迁移侵袭能力变化研究；④通过RNA干扰技术敲除BRF2基因,进一步检测BRF2基因在非小细胞肺癌肿瘤EMT过程中影响研究；第一部分BRF2蛋白表达与非小细胞肺癌血管生成及预后的相关性研究目的：检测在早期非小细胞肺癌组织中BRF2蛋白的表达水平,探讨BRF2蛋白表达与患者临床病理指标、肿瘤血管生成及预后的相关性。方法：选取2004年1月至2006年10月在山东大学齐鲁医院胸外科行手术治疗的早期非小细胞肺癌患者癌组织,应用免疫组化和RT—PCR方法检测107例非小细胞肺癌组织标本中BRF2蛋白及m-RNA表达水平,应用抗CD34抗体标记肿瘤组织内微血管内皮,并计数计算MVD；应用Western blot技术及RT-PCR技术检测新鲜肺癌组织及正常肺组织中BRF2蛋白表达水平；采用SPSS13.0软件建立数据库并对数据进行统计学分析。患者临床病理指标与BRF2蛋白、MVD计数与之间的关系应用χ2检验进行统计学分析,应用Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线,比较患者的生存差别应用Log-rank检验,Cox回归多因素分析判定独立的预后因素。结果：非小细胞肺癌组织、癌旁组织和正常肺组织中BRF2蛋白阳性表达率分别为55.14%、36.96%和34.38%,癌组织中BRF2蛋白的阳性表达率显著高于正常肺组织及癌旁组织(χ2=6.756,P=0.034),与患者临床病理指标无显著相关性(P0.05)；高MVD的表达率为56.07%,与肿瘤浸润深度显著相关(P=0.013)。Western blot技术及RT-PCR技术检测12对新鲜肺癌组织及癌旁组织中BRF2蛋白表达水平,结果显示8对组织中癌组织中BRF2蛋白及m-RNA表达水平均高于癌旁组织(P0.05)；χ2检验分析结果显示BRF2蛋白高表达与高MVD显著相关(P0.01)。单因素及多因素分析结果均显示BRF2蛋白高表达及高MVD均与患者术后高复发率及高死亡率有关；Cox回归多因素分析的结果显示,高MVD是判定患者无病生存率(P=0.008),总生存率(P=0.034)的独立预后因素,BRF2蛋白高表达也是判定患者无病生存率(P=0.006),总生存率(P=0.036)的独立预后因素。结论：BRF2蛋白高表达与早起非小细胞肺癌患者不良预后相关；BRF2蛋白高表达与肺癌组织血管生成有关；BRF2蛋白表达水平的检测可作为判定患者不良预后的参考指标。第二部分BRF2蛋白表达与食管癌血管生成及预后的相关性研究目的：检测在食管癌组织中BRF2蛋白的表达水平,探讨BRF2蛋白表达与患者临床病理指标、肿瘤血管生成及预后的相关性。方法：选取2002年1月至2003年8月在山东大学齐鲁医院胸外科行手术治疗的食管癌患者癌组织,应用免疫组化方法检测91例非小细胞肺癌组织标本中BRF2蛋白表达水平,应用抗CD34抗体标记肿瘤组织内微血管内皮,并计数计算MVD；采用SPSS13.0软件建立数据库并对数据进行统计学分析。患者临床病理指标与BRF2蛋白、MVD计数与之间的关系应用非参数检验(Mann-Whitney U test or Kruskal-Wallis H test)进行统计学分析,应用Kaplan-Meier法绘制患者的生存曲线,比较患者的生存差别应用Log-rank检验,Cox回归多因素分析判定独立的预后因素。结果：食管癌组织、癌旁组织及正常组织中BRF2蛋白高表达率分别为：53.85%、33.33%和30.63%；食管癌组织中BRF2蛋白高表达率高于癌旁组织及正常组织(P=0.043)。食管癌BRF2蛋白高表达与肿瘤患者肿瘤组织浸润深度T分期之间存在统计学意义(P=0.039)；食管癌高MVD与肿瘤患者吸烟(P=0.044)及临床分期(P=0.001)之间存在统计学意义。BRF2蛋白高表达与高MVD具有相关性(P=0.007)。单因素分析显示高MVD(P=0.003), BRF2蛋白高表达(P=0.001),较差的分化程度(P0.001),进展的临床分期(P0.001)及N分期(P0.001)预示了较差的5年生存期和5年无病生存期。多因素分析结果显示BRF2蛋白表达,MVD以及N分期为影响患者5年无病生存期的独立因素,但是仅BRF2蛋白表达,MVD为影响患者5年生存期的独立因素。结论：BRF2蛋白高表达与食管癌患者不良预后相关；BRF2蛋白高表达与食管癌组织血管生成有关；BRF2蛋白表达水平的检测可作为判定患者不良预后的参考指标。第三部分BRF2蛋白表达与非小细胞肺癌细胞体外迁移侵袭能力的相关性研究目的：应用RNA干扰技术特异性抑制非小细胞肺癌细胞内BRF2蛋白的表达,探讨BRF2蛋白表达与非小细胞肺癌细胞体外迁移、侵袭能力及体外内皮细胞成管能力的相关性。方法：采用western blot技术和RT-PCR技术检测非小细胞肺癌细胞株A549、H460、95-D和H292中BRF2 mRNA和蛋白的表达水平；以脂质体2000作为转染试剂,应用RNA干扰技术沉默BRF2基因,免疫组织荧光技术及Western Blot技术检测沉默效能；划痕实验检测沉默BRF2基因前后肺癌A549细胞体外迁移能力变化；Transwell实验检测沉默BRF2基因前后肺癌A549细胞侵袭能力变化；体外内皮细胞成管实验检测沉默BRF2基因前后肺癌A549细胞体外内皮细胞成管能力的变化；结果：BRF2 mRNA和蛋白在4种非小细胞肺癌细胞株中均存在不同程度的表达,其中A549细胞的表达水平最高,BRF2 siRNA转染48小时后,实时荧光定量PCR和,western blot检测结果发现A549细胞中BRF2基因的表达在mRNA(P0.01)和蛋白(P0.01)水平均被显著抑制。A549细胞内BRF2蛋白的表达被抑制后,划痕实验结果显示细胞的迁移能力显著降低(P0.01)；Transwell侵袭实验结果显示细胞的侵袭能力显著降低(P0.01)；体外内皮细胞成管实验结果显示细胞的体外内皮细胞成管能力显著降低(P0.01)。结论：在体外,抑制A549细胞中BRF2蛋白的表达后,细胞的迁移能力、侵袭能力及体外内皮细胞成管能力均显著降低,表明BRF2蛋白在A549细胞体外迁移侵袭过程中发挥重要的调控作用,BRF2蛋白可能成为抗非小细胞肺癌侵袭转移及血管生成治疗的新靶点。第四部分BRF2蛋白在非小细胞肺癌上皮间质转化过程中的作用研究目的：检测BRF2蛋白表达与EMT相关蛋白之间表达关系；应用RNA干扰技术特异性抑制非小细胞肺癌细胞内BRF2蛋白及EMT相关蛋白的表达,探讨BRF2蛋白表达对非小细胞肺癌细胞EMT相关特性的影响。方法：选取2005年1月至2006年12月在山东大学齐鲁医院胸外科行手术治疗的非小细胞肺癌患者癌组织,应用免疫组化技术方法检测77例非小细胞肺癌组织标本中BRF2蛋白及EMT相关蛋白表达水平,采用SPSS13.0软件建立数据库并对数据进行统计学分析,Mann-Whitney U非参数检验分析检测BRF2蛋白与EMT相关蛋白表达之间关系。应用RNA干扰技术沉默BRF2基因,免疫组织荧光技术及Western Blot技术检测沉默效能；采用western blot技术和RT-PCR技术检测非小细胞肺癌细胞株A549、SK-MES-1中BRF2及EMT相关蛋白mRNA和蛋白的表达；结果：BRF2蛋白表达与EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin之间表达存在相关性(P=0.048及P=0.045),与Snail蛋白表达之间无统计学意义(P=0.101)；Western Blot技术检测示细胞实验中BRF2基因沉默后,A549及SK-MES-1细胞系中BRF2蛋白表达降低,同时E-cadherin蛋白表达升高,N-cadherin蛋白及Snail蛋白表达下降；结论：BRF2蛋白表达与非小细胞肺癌EMT过程存在相关性；BRF2蛋白高表达促进了肿瘤EMT过程的发生发展。
【关键词】：BRF2蛋白 NSCLC 血管生成 不良预后 BRF2 食管癌 血管生成 预后 BRF2 A549细胞 侵袭迁移 RNA干扰 BRF2蛋白 非小细胞肺癌 EMT
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2;R735.1
【目录】：

• 中文摘要8-14
• 英文摘要14-22
• 符号说明22-25
• 第一部分 BRF2蛋白表达与早期非小细胞肺癌血管生成及预后的相关性研究25-54
• 前言25-27
• 材料方法27-36
• 结果36-38
• 讨论38-41
• 结论41-42
• 附图表42-50
• 参考文献50-54
• 第二部分 BRF2蛋白表达与食管癌血管生成及预后的相关性研究54-71
• 前言54-56
• 材料方法56-57
• 结果57-59
• 讨论59-60
• 结论60-61
• 附图表61-69
• 参考文献69-71
• 第三部分 BRF2蛋白表达与非小细胞肺癌细胞体外迁移侵袭能力的相关性研究71-86
• 前言71-72
• 材料方法72-75
• 结果75-77
• 讨论77-80
• 结论80-81
• 附图表81-84
• 参考文献84-86
• 第四部分 BRF2蛋白在非小细胞肺癌肿瘤细胞间质上皮转化过程中影响研究86-98
• 前言86-88
• 材料方法88-89
• 结果89-90
• 讨论90-92
• 结论92-93
• 附图表93-96
• 参考文献96-98
• 致谢98-99
• 攻读学位期间发表的学术论文目录99-100
• 学位论文评阅及答辩情况表100-101
• 英文文章Ⅰ101-124
• 英文文章Ⅱ124-140
• 英文文章Ⅲ140-155

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本文编号：263368