肿瘤相关炎症细胞的促肿瘤作用及机制研究

发布时间：2017-03-24 17:04

  本文关键词：肿瘤相关炎症细胞的促肿瘤作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：炎症,是肿瘤的十大特征之一。炎性微环境对肿瘤的影响成为新的研究热点。微环境中浸润的白细胞包括肥大细胞、T细胞、髓源性抑制细胞、自然杀伤细胞、肿瘤相关中性粒细胞(TAN)和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)等多种细胞亚型,他们是肿瘤微环境的重要组成成分,并发挥了肿瘤促进或抑制的重要作用。1.肺腺癌、咯血与炎症肺癌在世界范围内居于癌症相关死亡原因首位。肺癌患者最常见的症状包括咳嗽、呼吸困难、咯血等。尽管咯血是肺癌最常见的临床表现之一,但是治疗前咯血的发生情况尚无确切数据,且咯血的机制也尚未明确,尤其是对于轻到中度咯血。可能的机制涉及新血管生成、血管侵犯、肿瘤坏死、侵袭过程或咳嗽引起的损伤等,我们通过回顾性分析,发现咯血是肺腺癌根治术后的独立预后因素,肿瘤血管侵犯是咯血的重要原因,且咯血肺腺癌患者外周血中白细胞水平明显增高。为了进一步明确炎症、白细胞和肿瘤侵袭能力之间的相关性,我们进行了进一步的研究。2.肿瘤相关炎症慢性炎症是肿瘤微环境中的一个固有的特点。肿瘤相关炎症反应包括局部炎症反应和系统性炎症反应。巨噬细胞和中性粒细胞是浸润到肿瘤组织中的重要的免疫细胞。他们参与集体的防御机制,在损伤或感染的情况下发挥重要的作用。在肿瘤局部炎症反应中发挥着重要的作用。在肿瘤微环境的影响下,巨噬细胞可以表现出经典的激活状态(M1型)和选择性激活状态(M2)型并分别发挥抗肿瘤和促肿瘤的功能,在炎症和肿瘤的相互作用中发挥着重要的作用,目前相关研究已经较深入。与之相比,中性粒细胞的相关研究开展较晚。近来研究发现,与巨噬细胞类似,中性粒细胞在肿瘤微环境的调控下也能发挥抗肿瘤(N1型)或促肿瘤(N2型)的作用。其中TGF-β是巨噬细胞和中性粒细胞发生功能转换的重要调控因子。由于巨噬细胞和中性粒细胞特殊的促肿瘤作用,且肺腺癌咯血患者白细胞计数明显增高,我们对肺腺癌外周血白细胞亚型中单核细胞和中性粒细胞进行了分析,并发现咯血患者中性粒细胞水平明显增高,而单核细胞在咯血和非咯血患者中无明显差异。3.肿瘤相关中性粒细胞(TAN)循环中的中性粒细胞占白细胞的70%,在感染或者组织损伤时,它们被率先募集到病变部位,吞噬病原体,释放不同的效应分子。微环境中肿瘤细胞和间质细胞能够生成多种趋化因子,这些趋化因子被释放进入血液循环,与中性粒细胞表面高表达的CXCRl和CXCR2受体结合,通过趋化作用募集中性粒细胞迁移到肿瘤区域,进而发挥至关重要的作用。TAN参与肿瘤发生发展的各个环节,如肿瘤发生、发展、侵袭和转移等。然而临床研究中的TAN的作用尚存在争议,我们对相关文献进行了综述和meta分析,证实肿瘤内中性粒细胞浸润在头颈部肿瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌中是独立预后因素,然而在胃癌中,却无预后价值。对于TAN在食管癌中发挥的作用和机制尚不明确,我们在进一步的研究中对TAN在食管鳞癌的以及咯血肺腺癌中的作用进行了相关研究。4.TAN与上皮-间质转换(EMT)EMT是指有极性的上皮细胞转化成间质细胞,是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程,也是上皮来源的肿瘤细胞获得恶性表型的关键机制。EMT过程受TGF-β、Ras、Wnt等多条信号通路调节,其中TGF-β信号通路是诱导EMT的经典通路之一。TGF-β通过Smad依赖性通路和多条Smad非依赖性通路共同参与EMT过程。研究表明,TAN增强了肿瘤细胞的侵袭和转移能力,由于TAN的相关研究起步较晚,在其促进肿瘤细胞迁移及侵袭过程中所起的作用尚不明确。在胰腺癌细胞系中,TAN能诱导EMT,促进肿瘤细胞的侵袭和转移。在胃腺癌细胞系中,单核细胞和肿瘤细胞共培养促使肿瘤细胞产生更高水平的TGF-β 1,然而,上述研究均未对下游信号通路的激活情况及进一步的生物学效应进行深入研究。中性粒细胞和肿瘤细胞相互作用过程中,是否会对EMT的经典因子TGF-β产生影响未见报道。由于TGF-β在EMT和中性粒细胞功能转换中发挥的重要作用,以及中性粒细胞和单核细胞的功能相似性,我们推测,TAN与肿瘤细胞相互作用过程中,中性粒细胞诱导肿瘤细胞生成高水平的TGF-β1,进一步通过激活肿瘤细胞的TGF-β通路,诱导EMT的发生,促进了肿瘤的播散。肿瘤相关炎症细胞具有促肿瘤作用,肿瘤相关的炎症生物标志物成为新的预后因素。外周血中中性粒细胞淋巴细胞比率(NLR)已在多种实体瘤中被证实为独立的预后因素,而关于淋巴细胞单核细胞比率(LMR)在实体瘤中的作用的研究少见。肿瘤组织浸润的中性粒细胞和单核细胞是参与局部炎症反应的重要成分,而NLR与LMR在系统性炎症反应水平上反映了炎症细胞的促肿瘤作用。LMR在肺癌的预后价值未见报道,为此,我们对肺癌中LMR的预后作用进行了研究,并首次证实LMR为非小细胞肺癌(NSCLC)的独立预后因素。本课题将从咯血这一常见的临床表现入手,探讨咯血的预后价值及相关机制。并对研究中发现的咯血患者外周血白细胞水平明显升高这一现象进行深入研究,在局部炎症反应水平上探讨肿瘤相关炎症细胞的促肿瘤作用及可能机制,力图明确TAN在咯血肺腺癌和食管鳞癌中的作用和相关机制。此外,在系统性炎症反应水平上证实LMR在肺癌的重要预后价值。这将为阐明肿瘤相关炎症细胞的促肿瘤作用提供更为有利的依据。第一部分咯血是根治术后肺腺癌患者的独立预后因素[研究目的]1.明确咯血在肺腺癌中的预后价值；2.探讨肺腺癌咯血的相关机制。[研究方法]1.对根治术后肺腺癌患者进行了回顾性研究,以总生存期(OS)、无病生存期(DFS)、疾病特异性生存期(DSS)做为观察终点,分析了咯血的预后价值；2.探讨引起咯血的可能机制：利用免疫组织化学技术对肿瘤组织VEGF的表达、肿瘤坏死、血管侵犯以及微血管密度情况进行评估分析；3.分析咯血与临床病理特征的相关性。[结果]1.咯血在根治术后肺腺癌患者中是不良OS,DSS及DFS(p值均0.001)的重要预测因素；2.与非咯血组相比,咯血组肿瘤血管侵犯明显,而VEGF表达、肿瘤坏死和肿瘤周围微血管密度(MVD)两组间无明显差异；3.咯血与高水平白细胞计数(p=0.032)、高纤维蛋白原水平(Fib,p0.001)、较大的肿瘤最大直径(p0.001)、严重的血管侵犯(p=0.002)以及中心型肺癌(p0.001)相关。[结论]1.咯血是根治术后肺腺癌患者的重要预后因素。2.血管侵犯而不是血管生成或肿瘤坏死可能是肺腺癌患者咯血的最重要的机制。肿瘤周围微血管密度(MVD)两组间无明显差异；3.咯血与高水平白细胞计数(p=0.032)、高纤维蛋白原水平(Fib,p0.001)、较大的肿瘤最大直径(p0.001)、严重的血管侵犯(p=0.002)以及中心型肺癌(p0.001)相关。[结论]1.咯血是根治术后肺腺癌患者的重要预后因素。2.血管侵犯而不是血管生成或肿瘤坏死可能是肺腺癌患者咯血的最重要的机制。第二部分TAN促进肺腺癌细胞EMT[研究目的]1.明确咯血肺腺癌与外周血中白细胞亚型：中性粒细胞和单核细胞的相关性；2.在局部炎症反应水平探讨肿瘤组织中TAN的作用。[研究方法]1. Mann-Whitney U检验法比较咯血和非咯血组肺腺癌患者外周血单核细胞和中性粒细胞的分布差异；2.利用免疫组织化学方法检测肺腺癌肿瘤组织中CD66b+TAN及肿瘤组织E-cadherin的表达水平；3.建立中性粒细胞和肺腺癌细胞共培养模型,利用Western blot检测肿瘤细胞EMT相关指标的表达情况；4.利用ELISA检测肿瘤细胞培养基上清中TGF-β1的变化,RT-PCR检测TGF-β1的来源；5.利用transwell迁移实验检测不同培养条件下肿瘤细胞运动能力的变化。[结果]1.肺腺癌咯血与外周血中性粒细胞计数相关,与单核细胞计数无明显相关性；2.咯血与肿瘤组织中TAN浸润有显著的相关性,咯血组TAN浸润机率明显高于非咯血组(OR=4.25,95% CI 1.246-14.502);3.肿瘤组织中CD66+TAN浸润程度与E-cadherin表达负相关；4.体外实验证实中性粒细胞诱导肺腺癌细胞发生EMT,增强了肺腺癌细胞的迁移能力；5.共培养促进TGF-β l生成,肿瘤细胞是TGF-β1的主要来源；6.共培养促进肿瘤细胞Smad4入核,TGF-β/Smad通路被激活。[结论]1.肺腺癌咯血与中性粒细胞浸润明显相关；2.中性粒细胞能诱导肺腺癌细胞发生EMT, TGF-β/Smad通路可能是其关键通路；3.TAN能通过诱导肺腺癌细胞发生EMT,促进肿瘤的侵袭和转移,可能是导致咯血肺腺癌预后不良的重要因素。于非咯血组(OR=4.25,95% CI 1.246-14.502);3.肿瘤组织中CD66+TAN浸润程度与E-cadherin表达负相关；4.体外实验证实中性粒细胞诱导肺腺癌细胞发生EMT,增强了肺腺癌细胞的迁移能力；5.共培养促进TGF-β l生成,肿瘤细胞是TGF-β1的主要来源；6.共培养促进肿瘤细胞Smad4入核,TGF-β/Smad通路被激活。[结论]1.肺腺癌咯血与中性粒细胞浸润明显相关；2.中性粒细胞能诱导肺腺癌细胞发生EMT, TGF-β/Smad通路可能是其关键通路；3.TAN能通过诱导肺腺癌细胞发生EMT,促进肿瘤的侵袭和转移,可能是导致咯血肺腺癌预后不良的重要因素。第三部分 癌巢内TAN浸润诱导EMT促进了食管鳞癌的不良预后[研究目的]1.明确食管鳞癌巢内TAN的预后价值；2.在局部炎症反应水平上探讨TAN在食管鳞癌的作用机制。[研究方法]1.利用免疫组织化学技术评价癌巢内CD66+TAN的浸润情况,肿瘤组织中TGF-β1和E-cadherin的表达水平；2.利用体外共培养模型研究中性粒细胞和肿瘤细胞的相互作用;3. Western blot检测肿瘤细胞EMT相关指标在蛋白水平的变化;4. Transwell迁移实验检测食管鳞癌细胞运动能力的变化;5. ELISA检测不同培养条件下培养基上清中TGF-β1的变化;6.MTT实验检测不同培养条件下肿瘤细胞的增值能力;7.利用K-M生存曲线和COX比例风险模型研究TAN的预后价值。[结果]1.共有159名食管鳞癌患者并纳入该研究；2.食管鳞癌癌巢内TAN浸润与随访过程中发生的远处转移(Spearma n秩相关系数=0.429,p0.001)、肿瘤组织中TGF-β1表达水平(Spearma n秩相关系数=0.487,p0.001)、外周血中性粒细胞水平正相关(Spearman秩相关系数=0.432,p0.001)；与肿瘤组织中E-cadherin表达水平负相关(Spearman秩相关系数=-0.551,p0.001)；3.癌巢内TAN浸润是食管鳞癌的独立预后因素,多变量分析HR=2.453,95%CI,1.543-3.900;4.中性粒细胞和食管鳞癌细胞共培养导致E-cadherin下调,N-cadherin和Vimentin上调,EMT发生；5. Transwell迁移实验证实共培养导致肿瘤细胞迁移能力增强(p0.05)；6.培养基中TGF-β 1生成增加,肿瘤细胞TGF-β/Smad通路激活；7.MTT实验证实共培养促进了肿瘤细胞增殖(p0.05)。[结论]1.癌巢内TAN浸润是食管鳞癌的独立预后因素；2.中性粒细胞诱导食管癌细胞发生EMT,促进其增值,是其促进不良预后的重要因素。2.食管鳞癌癌巢内TAN浸润与随访过程中发生的远处转移(Spearma n秩相关系数=0.429,p0.001)、肿瘤组织中TGF-β1表达水平(Spearma n秩相关系数=0.487,p0.001)、外周血中性粒细胞水平正相关(Spearman秩相关系数=0.432,p0.001)；与肿瘤组织中E-cadherin表达水平负相关(Spearman秩相关系数=-0.551,p0.001)；3.癌巢内TAN浸润是食管鳞癌的独立预后因素,多变量分析HR=2.453,95%CI,1.543-3.900;4.中性粒细胞和食管鳞癌细胞共培养导致E-cadherin下调,N-cadherin和Vimentin上调,EMT发生；5. Transwell迁移实验证实共培养导致肿瘤细胞迁移能力增强(p0.05)；6.培养基中TGF-β 1生成增加,肿瘤细胞TGF-β/Smad通路激活；7.MTT实验证实共培养促进了肿瘤细胞增殖(p0.05)。[结论]1.癌巢内TAN浸润是食管鳞癌的独立预后因素；2.中性粒细胞诱导食管癌细胞发生EMT,促进其增值,是其促进不良预后的重要因素。第四部分系统性炎症反应为依据的LMR是肺癌的独立预后因素：基于大数据的临床资料分析[研究目的]1.在系统性炎症水平上探讨淋巴细胞单核细胞比率(LMR)在行根治术后切除的肺癌患者中是否为独立的预后因素；2.明确LMR在NSCLC和小细胞肺癌(SCLC)中是否具有相同的预后价值。[研究方法]1.回顾性分析从2006年1月到2011年12月在山东大学附属省立医院胸外科接受根治性手术的原发性肺癌患者；2.收集患者术前外周血淋巴细胞计数和单核细胞计数,并计算相应的LMR；3.以OS和DFS作为观察终点,利用K-M生存曲线和COX比例风险模型进行生存分析。[结果]1.共有1453名肺癌患者被纳入该研究；2.肺癌患者LMR与0S和DFS明显相关。以OS为观察终点时HR=1.522,95%CI：1.275-1.816；以DFS为观察终点时HR=1.338,95% CI：1.152-1.556；3.单变量亚组分析表明LMR仅在NSCLC中具有预后价值, 而在SCLC中,结果不具有统计学意义,HR=1.718,95% CI：0.946-3.122。多变量分析证实在NSCLC中LMR仍为重要的独立预后因子：以OS为观察终点时HR=1.511,95% CI：1.256-1.819：以DFS为观察终点时HR=1.335,95% CI：1.141-1.561。[结论]LMR是根治性切除的NSCLC患者的重要的独立预后因素。
【关键词】：肺腺癌 咯血 血管侵犯 预后 根治性切除 肿瘤相关中性粒细胞 肺腺癌 咯血 上皮-间质转化 肿瘤相关中性粒细胞 炎症 食管鳞癌 上皮间质转化 预后 淋巴细胞单核细胞比率 炎症 肺癌 预后
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 中文摘要8-15
• 英文摘要15-23
• 符号说明23-25
• 前言25-28
• 第一部分 咯血是根治术后肺腺癌患者的独立预后因素28-51
• 前言28-29
• 材料和方法29-32
• 结果32-34
• 讨论34-35
• 结论35-36
• 附录36-46
• 参考文献46-51
• 第二部分 TAN促进肺腺癌细胞EMT51-79
• 前言51-56
• 材料和方法56-64
• 结果64-66
• 讨论66-68
• 结论68-69
• 附录69-75
• 参考文献75-79
• 第三部分 癌巢内TAN浸润诱导EMT促进了食管癌的不良预后79-107
• 前言79-83
• 材料与方法83-89
• 结果89-91
• 讨论91-93
• 结论93-94
• 附录94-102
• 参考文献102-107
• 第四部分 系统性炎症反应为依据的LMR是肺癌的独立预后因素：基于大数据的临床资料分析107-121
• 前言107-108
• 材料和方法108-109
• 结果109-110
• 讨论110-111
• 结论111-112
• 附录112-118
• 参考文献118-121
• 致谢121-122
• 攻读学位期间发表的学术论文目录122-123
• 附表123-124
• 附件124-151

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  本文关键词：肿瘤相关炎症细胞的促肿瘤作用及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：265885