AMPK在炎症诱导的肝脏脂质沉积中的作用

发布时间：2017-03-25 02:05

  本文关键词：AMPK在炎症诱导的肝脏脂质沉积中的作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：临床研究发现,炎症可能参与了非酒精性脂肪肝(NAFLD)早期的脂肪沉积过程,但机制尚未阐明。因此,在本部分的研究中,我们旨在构建炎症诱导的肝脏脂质沉积的动物与细胞模型,为进一步的机制研究做准备。方法：①动物模型：酪蛋白是近年来常用的小鼠慢性炎症刺激因子,因此,我们将6-8周龄雄性C57BL/6J/、鼠随机分为炎症组(Casein,n=7)和对照组(NC,n=7)。炎症组隔日皮下注射0.5 ml10%酪蛋白,对照组注射相应剂量的生理盐水,总时间为18周。收集小鼠血清,检测炎症因子MCP-1、TNF-α、IL-6的水平。取小鼠肝脏组织经油红O染色、TG定量检测肝脏组织脂质沉积情况,qRT-PCR检测肝脏脂代谢关键基因的表达。②细胞模型1：在体内,Kupffer细胞是肝脏炎症的主要来源细胞,我们利用LPS刺激K.upffer细胞,检测其炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的含量,并用该上清液干预Hep(G2肝细胞,模拟体内Kupffer细胞与肝细胞共生长环境,后油红O染色、TG定量检测HepG2肝细胞内脂质沉积的变化,qRT-PCR检测肝细胞脂代谢关键基因的表达；③细胞模型2：TNF-α是重要的炎症因子之一,为了建立更为单纯的炎症干预的细胞模型,我们用外源性TNF-α 20ng/mL干预HepG2细胞24h后,油红O染色、TG定量检测HepG2细胞内脂质沉积情况,qRT-PCR以及Western blot方法检脂质合成关键基因的mRNA和蛋白水平的变化。结果：①动物模型：与对照组相比,酪蛋白注射显著增加C57BL/6J小鼠血中炎症因子MCP-1、TNF-α、IL-6的水平,肝脏脂质沉积明显,脂代谢紊乱。②细胞模型1：LPS刺激明显增加Kupffer细胞上清液中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的含量,上清液干预HepG2细胞后,细胞脂质含量显著增加,脂代谢异常。③细胞模型2：与对照组相比,TNF-α促进HepG2肝细胞内的脂质沉积,脂质合成关键基因SREBP1、FAS的表达明显升高。结论：成功构建炎症诱导的肝脂质沉积的动物与细胞模型。目的：腺苷酸活化蛋白激酶(Amp-activated protein kinase,AMPK)是生物体内重要的能量感受器,参与脂代谢过程。在第一部分的研究中,我们已经观察到炎症诱导肝脏脂质沉积。然而,在此过程中,AMPK通路是否发挥作用尚不清楚。因此,本部分的研究旨在炎症诱导的脂质沉积模型中,探讨AMPK通路的作用以及可能的机制,为非酒精性脂肪肝的防治提供新的思路。方法：estern blotting检测第一部分研究建立的炎症诱导的肝脏脂质沉积的动物与细胞模型中MPK以及下游ACC的磷酸化水平以反映AMPK通路激活情况；②探讨AMPK通路是否介导了炎症诱导的肝脏脂质沉积：在TNF-a诱导的HepG2肝细胞模型中,加用AMPK激动剂二甲双胍1mM或AICAR 1mM,或二甲双胍1mM联合AMPK抑制剂Compound C 40μM,干预24h后,通过油红O染色、TG定量检测观察细胞内脂质积聚情况；Western blotting和qRT-PCR检测细胞AMPK/mTOR/SREBP1通路的表达变化。结果：①与对照组相比,炎症小鼠肝脏组织AMPK以及下游ACC的磷酸化水平降低；Kupffer细胞上清液干预肝细胞后,肝细胞AMPK以及ACC磷酸化明显减少；在TNF-α作用下,HepG2细胞AMPK以及ACC磷酸化显著降低。②在TNF-α诱导的肝细胞脂质沉积模型中,加用二甲双胍或AICAR后,细胞内TG含量显著降低,脂质沉积得到改善,进一步检测发现,AMPK以及ACC磷酸化水平明显增加,AMPK激活增多, mTORSer2448以及p70S6K Thr421/Ser424位点的磷酸化水平显著降低,脂质合成关键基因SREBP1、FAS的表达显著减少；而加入二甲双胍联合Compound C后,AMPK以及ACC磷酸化水平降低,AMPK激活减少,mTORSer2448以及pThr421/Ser424位点的磷酸化水平显著增加,SREBP1、FAS的表达显著升高,TG含量增加,明显减弱二甲双胍对脂质沉积的改善作用。结论：AMPK磷酸化水平在炎症诱导的脂质沉积过程中显著降低,AMPK/mTOR/SREBP1通路可能介导了TNF-α诱导HepG2肝细胞内脂质积聚过程。
【关键词】：炎症 脂质沉积 脂代谢 Kupffer细胞 TNF-α AMPK 炎症 脂质沉积 mTOR SREBP1
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.5
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-18
• 第一部分 炎症诱导的肝脏脂质沉积模型的建立18-48
• 1 实验材料18-22
• 2 实验方法22-35
• 3 实验结果35-45
• 4 讨论45-48
• 第二部分 AMPK在炎症诱导的肝脏脂质沉积中的作用以及可能的机制48-59
• 1 实验材料48-49
• 2 实验方法49-50
• 3 实验结果50-57
• 4 讨论57-59
• 参考文献59-64
• 全文总结64-65
• 文献综述65-81
• 参考文献74-81
• 致谢81-82
• 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文目录82

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